Isolamento da microglia hipotalâmica do cérebro de camundongo adulto recém-perfundido por classificação de células ativadas por magnetismo

Summary

Descrevemos um protocolo para isolar células microgliais do hipotálamo de camundongo (ou pequenas estruturas cerebrais equivalentes) usando classificação de células ativadas magneticamente (MACS), em um tempo relativamente curto. A microglia hipotalâmica classificada por MACS pode ser usada para análise ex vivo e pode ser plaqueada para realizar ensaios in vitro .

Abstract

A microglia, como macrófagos residentes do cérebro, é essencial para manter a homeostase cerebral. Eles moldam os circuitos neuronais durante o desenvolvimento, pesquisam seu ambiente em busca de detritos ou células mortas, bem como respondem a infecções e lesões no cérebro, entre muitas outras funções. No entanto, seu importante papel no neurodesenvolvimento e na plasticidade e fisiopatologia sináptica não foi totalmente definido, destacando a necessidade de mais investigações. Para obter uma compreensão mais abrangente do papel da microglia nesses processos, precisamos isolar a microglia e caracterizá-la geneticamente, metabolicamente e funcionalmente. No entanto, o isolamento da microglia de camundongos adultos, especialmente de pequenas estruturas cerebrais, é um desafio, pois eles representam uma pequena porcentagem do total de células cerebrais, e o rendimento da microglia isolada costuma ser muito baixo. Aqui, o isolamento magnético da microglia usando microesferas CD11b ⁺ nos permite classificar as células microgliais do hipotálamo de um cérebro de camundongo adulto recém-perfundido. O método atual nos permite alcançar pureza e rendimento relativamente altos em um curto período, mantendo a viabilidade celular.

Introduction

A microglia corresponde a 5-20% do total de células neurais e são as únicas células gliais que se originam de progenitores eritromieloides no saco vitelino e começam a colonizar o cérebro em desenvolvimento por volta do dia embrionário E9.5 ^1,2. São células de vida longa com a capacidade de se auto-renovar lentamente, independentemente das células derivadas da medula óssea³. Como algumas das células mais altamente dinâmicas, elas são capazes de adquirir diversos fenótipos em resposta a pistas contextuais e ambientais ^2,4. Entre ....

Protocol

Todos os experimentos em animais descritos foram conduzidos em estrita conformidade com as recomendações da União Europeia (2013/63/UE) e foram aprovados pelo comitê de ética local da Universidade de Bordeaux (CEEA50) e pelo Ministério Francês de Ensino Superior, Pesquisa e Inovação (resumo não técnico do projeto aprovado NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022).

O protocolo a seguir é realizado em camundongos C57BL/6 adultos com idade média de 2 a 4 meses. No entanto, pode ser realizado em.......

Discussion

O protocolo atual apresenta o isolamento da microglia hipotalâmica do cérebro de camundongos adultos recém-perfundidos por Magnetic-Activated Cell Sorting. Os resultados apresentados acima confirmam a pureza e viabilidade das células isoladas, bem como a eficácia deste método para caracterizar funcionalmente a microglia ex vivo, por exemplo, através da atividade fagocítica e quantificação da produção de ROS. Métodos clássicos para o isolamento de uma população de células específica também pode.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	130-107-677	The kit contains buffer Z, buffer Y, enzymes A and P, Debris Removal Solution, buffer A (to dissolve enzyme A).
Albumin Bovine FrV BSA	EuroMedex	04-100-812-C
CD11b (Microglia) MicroBeads, human and mouse - small size	Miltenyi	130-093-636
CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10492
Centrifuge Tube, Snap-Pop Lid 15 mL	CellTreat	978449
DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvate	Gibco	14287-072
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi	130-096-427
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)	Thermofisher	78420
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x)	Thermofisher	78437
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red	Thermofisher	14065056
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red	Sigma-Aldrich	L3280
LightCycler 480 SYBR Green I Master	Roche	4707516001	This reagent was used to perform PCR.
MACS SmartStrainers (70 µm)	Miltenyi	130-110-916
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermofisher	23235
M-PER Mammalian Extraction Buffer	Thermofisher	78503
MS Columns	Miltenyi	130-042-201	Referred as small columns in the protocol.
MultiMACS Cell24 Separator Plus	Miltenyi	130-098-637
PBSS, pH 7.4	Thermofisher	10010023
qScript XLT cDNA SuperMix	Quanta biosciences	733-1177	The kit was used to syntesize cDNA.
ReliaPrep RNA Miniprep Systems	Promega	Z6011	The kit contains 1-Thioglycerol and BL buffer (referred as lysis buffer in the protocol) and it was used to isolate total RNA.
Vacutainer safety-lok 21 G	Becton Dickinson	367282