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Este protocolo descreve uma técnica para a análise de supercomplexos respiratórios quando apenas pequenas quantidades de amostras estão disponíveis.
Nas últimas décadas, as evidências acumuladas sobre a existência de supercomplexos respiratórios (SCs) mudaram nossa compreensão da organização da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, dando origem à proposta do "modelo de plasticidade". Este modelo postula a coexistência de diferentes proporções de CTs e complexos dependendo do tecido ou do estado metabólico celular. A natureza dinâmica da montagem em SCs permitiria que as células otimizassem o uso dos combustíveis disponíveis e a eficiência da transferência de elétrons, minimizando a geração de espécies reativas de oxigênio e favorecendo a capacidade das células de se adaptarem às mudanças ambientais.
Mais recentemente, anormalidades na montagem de SC foram relatadas em diferentes doenças, como distúrbios neurodegenerativos (doença de Alzheimer e Parkinson), Síndrome de Barth, síndrome de Leigh ou câncer. O papel das alterações da montagem do CS na progressão da doença ainda precisa ser confirmado. No entanto, a disponibilidade de quantidades suficientes de amostras para determinar o status da montagem do SC é muitas vezes um desafio. Isso acontece com biópsias ou amostras de tecido que são pequenas ou precisam ser divididas para múltiplas análises, com culturas de células que têm crescimento lento ou vêm de dispositivos microfluídicos, com algumas culturas primárias ou células raras, ou quando o efeito de determinados tratamentos caros tem que ser analisado (com nanopartículas, compostos muito caros, etc.). Nesses casos, é necessário um método eficiente e fácil de aplicar. Este trabalho apresenta um método adaptado para obter frações mitocondriais enriquecidas a partir de pequenas quantidades de células ou tecidos para analisar a estrutura e função de SCs mitocondriais por eletroforese nativa seguida de ensaios de atividade em gel ou western blot.
Supercomplexos (SCs) são associações supramoleculares entre complexos individuais da cadeia respiratória 1,2. Desde a identificação inicial das CTs e a descrição de sua composição pelo grupo de Schägger 2,3, posteriormente confirmada por outros grupos, estabeleceu-se que elas contêm complexos respiratórios I, III e IV (IC, CIII e CIV, respectivamente) em diferentes estequiometrias. Duas populações principais de SCs podem ser definidas, aquelas contendo CI (e CIII sozinho ou CIII e CIV) e com peso molecular muito alto (MW, começando ~ 1,5 MDa para o SC ....
NOTA: A composição de todos os meios de cultura e tampões é especificada na Tabela 1 e os detalhes relacionados a todos os materiais e reagentes usados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Isolamento de mitocôndrias de cultura de células
NOTA: O volume mínimo de células analisadas foi de ~ 30-50 μL de células empacotadas (etapa 1.4). Isso pode corresponder aproximadamente a pelo menos d.......
Os rendimentos das mitocôndrias obtidos seguindo os protocolos descritos acima variam dependendo de vários fatores, como a linha celular ou tipo de tecido, a natureza das amostras (ou seja, se são usados tecidos frescos ou congelados) ou a eficiência do processo de homogeneização. Os rendimentos esperados de mitocôndrias de diferentes linhagens celulares e tecidos são coletados na Tabela 2. Uma vez obtidas as frações mitocondriais, o próximo passo é a análise do padrão das CTs respiratória.......
As adaptações metodológicas introduzidas nos protocolos aqui descritos visam evitar perdas e aumentar o rendimento, mantendo as atividades do complexo mitocondrial (o que é crucial quando a disponibilidade de quantidades suficientes de amostras está comprometida) e reproduzir o padrão esperado de SCs do tecido ou da linhagem celular (ver Figura 2C). Com esse objetivo e como não é necessária uma alta pureza mitocondrial para detectar adequadamente os SCs, o número de etapas, tempos .......
Este trabalho foi apoiado pela bolsa número "PGC2018-095795-B-I00" do Ministério de Ciência e Inovação (https://ciencia.sede.gob.es/) e pelas bolsas "Grupo de Referência: E35_17R" e bolsa número "LMP220_21" da Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) para PF-S e RM-L.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetic acid | PanReac | 131008 | |
Aminocaproic acid | Fluka Analytical | 7260 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Bis Tris | Acrons Organics | 327721000 | |
Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
Coomassie Blue G-250 | Serva | 17524 | |
Coomassie Blue R-250 | Merck | 1125530025 | |
Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | |
Diamino benzidine (DAB) | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
EDTA | PanReac | 131669 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Fatty acids free BSA | Roche | 10775835001 | |
Glycine | PanReac | A1067 | |
Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
K2HPO4 | PanReac | 121512 | |
KH2PO4 | PanReac | 121509 | |
Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
Methanol | Labkem | MTOL-P0P | |
MgSO4 | PanReac | 131404 | |
Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
MTCO1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459600 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NADH | Roche | 10107735001 | |
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels | Invitrogen | BN1001BOX | |
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x) | Invitrogen | BN2002 | |
NativePAGE Running Buffer (20x) | Invitrogen | BN2001 | |
NDUFA9 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459100 | |
Nitroblue tetrazolium salt (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 | |
Pb(NO3)2 | Sigma-Aldrich | 228621 | |
PDVF Membrane | Amersham | 10600023 | |
Phenazine methasulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 | |
Pierce ECL Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
PMSF | Merck | PMSF-RO | |
SDHA Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459200 | |
Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
Tris | PanReac | A2264 | |
UQCRC1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459140 | |
XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
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