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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo descreve uma técnica para a análise de supercomplexos respiratórios quando apenas pequenas quantidades de amostras estão disponíveis.

Abstract

Nas últimas décadas, as evidências acumuladas sobre a existência de supercomplexos respiratórios (SCs) mudaram nossa compreensão da organização da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, dando origem à proposta do "modelo de plasticidade". Este modelo postula a coexistência de diferentes proporções de CTs e complexos dependendo do tecido ou do estado metabólico celular. A natureza dinâmica da montagem em SCs permitiria que as células otimizassem o uso dos combustíveis disponíveis e a eficiência da transferência de elétrons, minimizando a geração de espécies reativas de oxigênio e favorecendo a capacidade das células de se adaptarem às mudanças ambientais.

Mais recentemente, anormalidades na montagem de SC foram relatadas em diferentes doenças, como distúrbios neurodegenerativos (doença de Alzheimer e Parkinson), Síndrome de Barth, síndrome de Leigh ou câncer. O papel das alterações da montagem do CS na progressão da doença ainda precisa ser confirmado. No entanto, a disponibilidade de quantidades suficientes de amostras para determinar o status da montagem do SC é muitas vezes um desafio. Isso acontece com biópsias ou amostras de tecido que são pequenas ou precisam ser divididas para múltiplas análises, com culturas de células que têm crescimento lento ou vêm de dispositivos microfluídicos, com algumas culturas primárias ou células raras, ou quando o efeito de determinados tratamentos caros tem que ser analisado (com nanopartículas, compostos muito caros, etc.). Nesses casos, é necessário um método eficiente e fácil de aplicar. Este trabalho apresenta um método adaptado para obter frações mitocondriais enriquecidas a partir de pequenas quantidades de células ou tecidos para analisar a estrutura e função de SCs mitocondriais por eletroforese nativa seguida de ensaios de atividade em gel ou western blot.

Introduction

Supercomplexos (SCs) são associações supramoleculares entre complexos individuais da cadeia respiratória 1,2. Desde a identificação inicial das CTs e a descrição de sua composição pelo grupo de Schägger 2,3, posteriormente confirmada por outros grupos, estabeleceu-se que elas contêm complexos respiratórios I, III e IV (IC, CIII e CIV, respectivamente) em diferentes estequiometrias. Duas populações principais de SCs podem ser definidas, aquelas contendo CI (e CIII sozinho ou CIII e CIV) e com peso molecular muito alto (MW, começando ~ 1,5 MDa para o SC ....

Protocol

NOTA: A composição de todos os meios de cultura e tampões é especificada na Tabela 1 e os detalhes relacionados a todos os materiais e reagentes usados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento de mitocôndrias de cultura de células

NOTA: O volume mínimo de células analisadas foi de ~ 30-50 μL de células empacotadas (etapa 1.4). Isso pode corresponder aproximadamente a pelo menos d.......

Representative Results

Os rendimentos das mitocôndrias obtidos seguindo os protocolos descritos acima variam dependendo de vários fatores, como a linha celular ou tipo de tecido, a natureza das amostras (ou seja, se são usados tecidos frescos ou congelados) ou a eficiência do processo de homogeneização. Os rendimentos esperados de mitocôndrias de diferentes linhagens celulares e tecidos são coletados na Tabela 2. Uma vez obtidas as frações mitocondriais, o próximo passo é a análise do padrão das CTs respiratória.......

Discussion

As adaptações metodológicas introduzidas nos protocolos aqui descritos visam evitar perdas e aumentar o rendimento, mantendo as atividades do complexo mitocondrial (o que é crucial quando a disponibilidade de quantidades suficientes de amostras está comprometida) e reproduzir o padrão esperado de SCs do tecido ou da linhagem celular (ver Figura 2C). Com esse objetivo e como não é necessária uma alta pureza mitocondrial para detectar adequadamente os SCs, o número de etapas, tempos .......

Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela bolsa número "PGC2018-095795-B-I00" do Ministério de Ciência e Inovação (https://ciencia.sede.gob.es/) e pelas bolsas "Grupo de Referência: E35_17R" e bolsa número "LMP220_21" da Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) para PF-S e RM-L.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidPanReac131008
Aminocaproic acidFluka Analytical7260
ATPSigma-AldrichA2383
Bis TrisAcrons Organics327721000
Bradford assayBiorad5000002
Coomassie Blue G-250Serva17524
Coomassie Blue R-250Merck1125530025
Cytochrome cSigma-AldrichC2506
Diamino  benzidine (DAB)Sigma-AldrichD5637
DigitoninSigma-AldrichD5628
EDTAPanReac131669
EGTASigma-AldrichE3889
Fatty acids free BSARoche10775835001
GlycinePanReacA1067
Homogenizer Teflon pestleDeltalab196102
ImidazoleSigma-AldrichI2399
K2HPO4PanReac121512
KH2PO4PanReac121509
MannitolSigma-AldrichM4125
MethanolLabkemMTOL-P0P
MgSO4PanReac131404
Mini Trans-Blot CellBioRad1703930
MOPSSigma-AldrichM1254
MTCO1 Monoclonal AntibodyInvitrogen459600
NaClSigma-AldrichS9888
NADHRoche10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein GelsInvitrogenBN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)InvitrogenBN2002
NativePAGE Running Buffer (20x) InvitrogenBN2001
NDUFA9 Monoclonal AntibodyInvitrogen459100
Nitroblue tetrazolium salt (NBT)Sigma-AldrichN6876
Pb(NO3)2Sigma-Aldrich228621
PDVF MembraneAmersham10600023
Phenazine methasulfate (PMS)Sigma-AldrichP9625
Pierce ECL SubstrateThermo Scientific32106
PMSFMerckPMSF-RO
SDHA Monoclonal AntibodyInvitrogen459200
Sodium succinateSigma-AldrichS2378
Streptomycin/penicillinPAN biotechP06-07100
SucroseSigma-AldrichS3089
TrisPanReacA2264
UQCRC1 Monoclonal AntibodyInvitrogen459140
XCell SureLock Mini-CellInvitrogen EI0001

References

  1. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  2. Schagger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respirato....

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