A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Этот протокол описывает методику анализа дыхательных суперкомплексов при наличии только небольшого количества образцов.
За последние десятилетия накопленные данные о существовании дыхательных суперкомплексов (СК) изменили наше представление об организации митохондриальной электронно-транспортной цепи, что привело к предложению «модели пластичности». Эта модель постулирует сосуществование различных пропорций СК и комплексов в зависимости от ткани или метаболического статуса клеток. Динамический характер сборки в СК позволит клеткам оптимизировать использование доступного топлива и эффективность переноса электронов, сводя к минимуму образование активных форм кислорода и способствуя способности клеток адаптироваться к изменениям окружающей среды.
В последнее время сообщалось об аномалиях сборки СК при различных заболеваниях, таких как нейродегенеративные расстройства (болезнь Альцгеймера и Паркинсона), синдром Барта, синдром Ли или рак. Роль изменений сборки СК в прогрессировании заболевания все еще нуждается в подтверждении. Тем не менее, наличие достаточного количества образцов для определения состояния сборки SC часто является проблемой. Это происходит с биопсией или образцами тканей, которые малы или должны быть разделены для нескольких анализов, с культурами клеток, которые имеют медленный рост или получены из микрофлюидных устройств, с некоторыми первичными культурами или редкими клетками, или когда необходимо проанализировать эффект конкретных дорогостоящих методов лечения (с наночастицами, очень дорогими соединениями и т. д.). В этих случаях требуется эффективный и простой в применении метод. В данной работе представлен метод, адаптированный для получения обогащенных митохондриальных фракций из небольшого количества клеток или тканей для анализа структуры и функции митохондриальных СК с помощью нативного электрофореза с последующим анализом активности в геле или вестерн-блоттингом.
Суперкомплексы (СК) представляют собой супрамолекулярные ассоциации между отдельными комплексами дыхательной цепи 1,2. Поскольку первоначальная идентификация СК и описание их состава по группе Шеггера 2,3, в дальнейшем подтвержденные другими группами, было установлено, что они содержат дыхательные комплексы I, III и IV (CI, CIII и CIV соответственно) в разных стехиометриях. Можно выделить две основные популяции СК: содержащие ДИ (и либо только CIII, либо CIII и CIV) и с очень высокой молекулярной массой (MW, начиная с ~1,5 MDa для меньших SC: CI + CIII....
ПРИМЕЧАНИЕ: Состав всех питательных сред и буферов указан в таблице 1 , а подробности, относящиеся ко всем материалам и реагентам, используемым в этом протоколе, перечислены в таблице материалов.
1. Выделение митохондрий из клеточной культуры
Выход митохондрий, полученных в соответствии с описанными выше протоколами, варьируется в зависимости от нескольких факторов, таких как клеточная линия или тип ткани, характер образцов (т.е. используются ли свежие или замороженные ткани) или эффективность процесса гомогенизации. Ожида.......
Методологические адаптации, внесенные в описанные здесь протоколы, призваны избежать потерь и увеличить выход при сохранении активности митохондриального комплекса (что имеет решающее значение при ограничении доступности достаточного количества образцов) и воспроизвести ожидаемый.......
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Эта работа была поддержана грантом No "PGC2018-095795-B-I00" от Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) и грантами "Grupo de Referencia: E35_17R" и грантом No "LMP220_21" от Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) для PF-S и RM-L.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetic acid | PanReac | 131008 | |
Aminocaproic acid | Fluka Analytical | 7260 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Bis Tris | Acrons Organics | 327721000 | |
Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
Coomassie Blue G-250 | Serva | 17524 | |
Coomassie Blue R-250 | Merck | 1125530025 | |
Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | |
Diamino benzidine (DAB) | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
EDTA | PanReac | 131669 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Fatty acids free BSA | Roche | 10775835001 | |
Glycine | PanReac | A1067 | |
Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
K2HPO4 | PanReac | 121512 | |
KH2PO4 | PanReac | 121509 | |
Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
Methanol | Labkem | MTOL-P0P | |
MgSO4 | PanReac | 131404 | |
Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
MTCO1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459600 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NADH | Roche | 10107735001 | |
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels | Invitrogen | BN1001BOX | |
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x) | Invitrogen | BN2002 | |
NativePAGE Running Buffer (20x) | Invitrogen | BN2001 | |
NDUFA9 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459100 | |
Nitroblue tetrazolium salt (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 | |
Pb(NO3)2 | Sigma-Aldrich | 228621 | |
PDVF Membrane | Amersham | 10600023 | |
Phenazine methasulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 | |
Pierce ECL Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
PMSF | Merck | PMSF-RO | |
SDHA Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459200 | |
Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
Tris | PanReac | A2264 | |
UQCRC1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459140 | |
XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved