Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Этот протокол описывает методику анализа дыхательных суперкомплексов при наличии только небольшого количества образцов.

Abstract

За последние десятилетия накопленные данные о существовании дыхательных суперкомплексов (СК) изменили наше представление об организации митохондриальной электронно-транспортной цепи, что привело к предложению «модели пластичности». Эта модель постулирует сосуществование различных пропорций СК и комплексов в зависимости от ткани или метаболического статуса клеток. Динамический характер сборки в СК позволит клеткам оптимизировать использование доступного топлива и эффективность переноса электронов, сводя к минимуму образование активных форм кислорода и способствуя способности клеток адаптироваться к изменениям окружающей среды.

В последнее время сообщалось об аномалиях сборки СК при различных заболеваниях, таких как нейродегенеративные расстройства (болезнь Альцгеймера и Паркинсона), синдром Барта, синдром Ли или рак. Роль изменений сборки СК в прогрессировании заболевания все еще нуждается в подтверждении. Тем не менее, наличие достаточного количества образцов для определения состояния сборки SC часто является проблемой. Это происходит с биопсией или образцами тканей, которые малы или должны быть разделены для нескольких анализов, с культурами клеток, которые имеют медленный рост или получены из микрофлюидных устройств, с некоторыми первичными культурами или редкими клетками, или когда необходимо проанализировать эффект конкретных дорогостоящих методов лечения (с наночастицами, очень дорогими соединениями и т. д.). В этих случаях требуется эффективный и простой в применении метод. В данной работе представлен метод, адаптированный для получения обогащенных митохондриальных фракций из небольшого количества клеток или тканей для анализа структуры и функции митохондриальных СК с помощью нативного электрофореза с последующим анализом активности в геле или вестерн-блоттингом.

Introduction

Суперкомплексы (СК) представляют собой супрамолекулярные ассоциации между отдельными комплексами дыхательной цепи 1,2. Поскольку первоначальная идентификация СК и описание их состава по группе Шеггера 2,3, в дальнейшем подтвержденные другими группами, было установлено, что они содержат дыхательные комплексы I, III и IV (CI, CIII и CIV соответственно) в разных стехиометриях. Можно выделить две основные популяции СК: содержащие ДИ (и либо только CIII, либо CIII и CIV) и с очень высокой молекулярной массой (MW, начиная с ~1,5 MDa для меньших SC: CI + CIII....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Состав всех питательных сред и буферов указан в таблице 1 , а подробности, относящиеся ко всем материалам и реагентам, используемым в этом протоколе, перечислены в таблице материалов.

1. Выделение митохондрий из клеточной культуры

Representative Results

Выход митохондрий, полученных в соответствии с описанными выше протоколами, варьируется в зависимости от нескольких факторов, таких как клеточная линия или тип ткани, характер образцов (т.е. используются ли свежие или замороженные ткани) или эффективность процесса гомогенизации. Ожида.......

Discussion

Методологические адаптации, внесенные в описанные здесь протоколы, призваны избежать потерь и увеличить выход при сохранении активности митохондриального комплекса (что имеет решающее значение при ограничении доступности достаточного количества образцов) и воспроизвести ожидаемый.......

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантом No "PGC2018-095795-B-I00" от Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) и грантами "Grupo de Referencia: E35_17R" и грантом No "LMP220_21" от Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) для PF-S и RM-L.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidPanReac131008
Aminocaproic acidFluka Analytical7260
ATPSigma-AldrichA2383
Bis TrisAcrons Organics327721000
Bradford assayBiorad5000002
Coomassie Blue G-250Serva17524
Coomassie Blue R-250Merck1125530025
Cytochrome cSigma-AldrichC2506
Diamino  benzidine (DAB)Sigma-AldrichD5637
DigitoninSigma-AldrichD5628
EDTAPanReac131669
EGTASigma-AldrichE3889
Fatty acids free BSARoche10775835001
GlycinePanReacA1067
Homogenizer Teflon pestleDeltalab196102
ImidazoleSigma-AldrichI2399
K2HPO4PanReac121512
KH2PO4PanReac121509
MannitolSigma-AldrichM4125
MethanolLabkemMTOL-P0P
MgSO4PanReac131404
Mini Trans-Blot CellBioRad1703930
MOPSSigma-AldrichM1254
MTCO1 Monoclonal AntibodyInvitrogen459600
NaClSigma-AldrichS9888
NADHRoche10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein GelsInvitrogenBN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)InvitrogenBN2002
NativePAGE Running Buffer (20x) InvitrogenBN2001
NDUFA9 Monoclonal AntibodyInvitrogen459100
Nitroblue tetrazolium salt (NBT)Sigma-AldrichN6876
Pb(NO3)2Sigma-Aldrich228621
PDVF MembraneAmersham10600023
Phenazine methasulfate (PMS)Sigma-AldrichP9625
Pierce ECL SubstrateThermo Scientific32106
PMSFMerckPMSF-RO
SDHA Monoclonal AntibodyInvitrogen459200
Sodium succinateSigma-AldrichS2378
Streptomycin/penicillinPAN biotechP06-07100
SucroseSigma-AldrichS3089
TrisPanReacA2264
UQCRC1 Monoclonal AntibodyInvitrogen459140
XCell SureLock Mini-CellInvitrogen EI0001

References

  1. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  2. Schagger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respirato....

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved