从人肌间脂肪组织中分离细胞核和下游单核 RNA 测序

Summary

由于人体组织的可及性有限，肌间脂肪组织 （IMAT） 的生物学在很大程度上尚未得到探索。在这里，我们提出了用于单核RNA测序的冷冻人IMAT的细胞核分离和文库制备的详细方案，以鉴定这种独特脂肪库的细胞组成。

Abstract

肌间脂肪组织 （IMAT） 是一种相对未被充分研究的脂肪库，位于肌肉纤维之间。IMAT含量随着年龄和BMI的增加而增加，并与代谢和肌肉退行性疾病有关;然而，对IMAT的生物学特性及其与周围肌肉纤维的相互作用的理解严重缺乏。近年来，单细胞和细胞核RNA测序为我们提供了几种人体组织的细胞类型特异性图谱。然而，由于人类 IMAT 在活检采集中具有固有的挑战，因此人类 IMAT 的细胞组成在很大程度上仍未被探索。除了收集的组织数量有限外，由于人IMAT靠近骨骼肌组织和筋膜，因此其处理也很复杂。脂肪细胞的脂质含量使其与单细胞分离不相容。因此，单核RNA测序是获得单细胞分辨率高维转录组学的最佳方法，并有可能揭示该库的生物学特性，包括IMAT的确切细胞组成。在这里，我们提出了用于单核RNA测序的冷冻人IMAT的细胞核分离和文库制备的详细方案。该协议允许使用基于液滴的方法分析数千个细胞核，从而提供检测稀有和低丰度细胞类型的能力。

Introduction

肌间脂肪组织 （IMAT） 是一种异位脂肪库，位于肌纤维之间和周围¹。正如Goodpaster等人最近的一篇综述中详细描述的那样，IMAT可以使用高分辨率计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）来检测（图1A，B），并且可以在整个身体的肌肉纤维周围和内部发现¹。IMAT的数量因人而异，并受BMI、年龄、性别、种族和久坐的影响^2,3,4。此外，IMAT 沉积常见于与肌肉退化相关的病理状况⁵，许多研究记录了肥胖、2 型糖尿病、代谢综合征和胰岛素抵抗患者的 IMAT 质量增加 ^6,7,8,9。尽管如此，IMAT的细胞和生物学特性才刚刚开始被揭示。有限的可及性以及整个身体中 IMAT 位置和内容的变化，对从这种独特的脂肪库²

Protocol

用于该协议的样本是肌肉、活动性和衰老研究 （SOMMA）¹⁵ 的一部分^，该研究由西方 IRB-哥白尼小组 （WCG） 机构审查委员会批准，并根据赫尔辛基宣言进行。参与者为参与研究提供了书面知情同意书。

注：该协议改编自先前的协议，在基于纳米孔的平台¹⁶上使用100mg人腹部皮下脂肪组织。当前方案针对 50 mg 人 IMAT 和使用基于液滴的平.......

Discussion

与IMAT合作存在一些固有的挑战。除了可及性有限外，样品材料的产量通常非常稀缺，骨骼肌的“污染”几乎是无法避免的。为了获得最高质量的样本，在插入活检针时应穿透肌肉筋膜（以确保不收集皮下脂肪组织），并在收集后立即在显微镜下解剖样本以去除尽可能多的肌肉组织，然后进行组织学处理、快速冷冻等。这是第一种利用从骨骼肌中前瞻性收集和解剖的IMAT样本的方法。相比之下，IMAT?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm corning syringe filters	Millipore Sigma	CLS431229
1.7 mL DNA LoBind tubes	Eppendorf	22431021	low-bind tubes
10% Tween 20	Bio-Rad	1662404
100x protease inhibitor	Thermo Fisher Scientific	78437
10X Magnetic Separator	10X Genomics	230003
10X Vortex Adapter	10X Genomics	330002
15 mL canonical tubes	Sarstedt	6,25,54,502
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA
50 mL conical tubes	Sarstedt	6,25,47,254
CellRanger	Genomics	N/A
Chromium iX accesory kit	10X Genomics	PN1000323
Chromium iX Controller	10X Genomics	PN1000326
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit	10X Genomics	PN1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3'  Kit v 3.1	10X Genomics	PN1000269
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1	10X Genomics	PN1000129
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.1	10X Genomics	PN1000130
Countess 3 Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX2000	Automated cell counter
Countess cell counting chamber slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
DoubletFinder	R	N/A
DPBS (no calcium, no magnesium)	Thermo Fisher Scientific	14190144
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns	10X Genomics	PN1000215
Dynabeads MyOne SILANE	10X Genomics	PN2000048
Falcon 100 µm Cell strainer	Corning Life Science	352360
Falcon 40 µm Cell strainer	Corning Life Science	352340
Glycerin (glycerol), 50% (v/v) Aqueous Solution	Ricca Chemical Company	3290-32
KCL	Thermo Fisher Scientific	AM9640G
Library Construction Kit v3.1	10X Genomics	PN1000196
MACS SmartStrainers (30µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cycler	Eppendorf	6331000017
MgCl2	Ambion	AM9530G
Mortar and pestel	Health care logistics	14075
NucBlue Live Ready Probes Reagent	Thermo Fisher Scientific	R37605
Nuclease Free Water (not DEPC treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9930
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder	Sigma-Aldrich	820024
Qiagen Buffer EB	Qiagen	19086
Ribolock RNAse inhibitor	Thermo Fisher Scientific	EO0382
Seurat	R	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
SUPERasin 20 U/µL	Thermo Fisher Scientific	AM2695
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000015
Tissue homogenizer	Glass-Col	099C K54
Tris buffer pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	AM9855G
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	AC327372500
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0	Gibco	15575020