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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

由于人体组织的可及性有限,肌间脂肪组织 (IMAT) 的生物学在很大程度上尚未得到探索。在这里,我们提出了用于单核RNA测序的冷冻人IMAT的细胞核分离和文库制备的详细方案,以鉴定这种独特脂肪库的细胞组成。

Abstract

肌间脂肪组织 (IMAT) 是一种相对未被充分研究的脂肪库,位于肌肉纤维之间。IMAT含量随着年龄和BMI的增加而增加,并与代谢和肌肉退行性疾病有关;然而,对IMAT的生物学特性及其与周围肌肉纤维的相互作用的理解严重缺乏。近年来,单细胞和细胞核RNA测序为我们提供了几种人体组织的细胞类型特异性图谱。然而,由于人类 IMAT 在活检采集中具有固有的挑战,因此人类 IMAT 的细胞组成在很大程度上仍未被探索。除了收集的组织数量有限外,由于人IMAT靠近骨骼肌组织和筋膜,因此其处理也很复杂。脂肪细胞的脂质含量使其与单细胞分离不相容。因此,单核RNA测序是获得单细胞分辨率高维转录组学的最佳方法,并有可能揭示该库的生物学特性,包括IMAT的确切细胞组成。在这里,我们提出了用于单核RNA测序的冷冻人IMAT的细胞核分离和文库制备的详细方案。该协议允许使用基于液滴的方法分析数千个细胞核,从而提供检测稀有和低丰度细胞类型的能力。

Introduction

肌间脂肪组织 (IMAT) 是一种异位脂肪库,位于肌纤维之间和周围1。正如Goodpaster等人最近的一篇综述中详细描述的那样,IMAT可以使用高分辨率计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)来检测(图1A,B),并且可以在整个身体的肌肉纤维周围和内部发现1。IMAT的数量因人而异,并受BMI、年龄、性别、种族和久坐的影响2,3,4。此外,IMAT 沉积常见于与肌肉退化相关的病理状况5,许多研究记录了肥胖、2 型糖尿病、代谢综合征和胰岛素抵抗患者的 IMAT 质量增加 6,7,8,9尽管如此,IMAT的细胞和生物学特性才刚刚开始被揭示。有限的可及性以及整个身体中 IMAT 位置和内容的变化,对从这种独特的脂肪库2

Protocol

用于该协议的样本是肌肉、活动性和衰老研究 (SOMMA)15 的一部分该研究由西方 IRB-哥白尼小组 (WCG) 机构审查委员会批准,并根据赫尔辛基宣言进行。参与者为参与研究提供了书面知情同意书。

注:该协议改编自先前的协议,在基于纳米孔的平台16上使用100mg人腹部皮下脂肪组织。当前方案针对 50 mg 人 IMAT 和使用基于液滴的平.......

Representative Results

该工作流程旨在指导冷冻人IMAT样品的处理,以获得单核分辨率的基因表达谱,从而实现细胞类型鉴定。在这里,展示了来自SOMMA研究参与者的一个代表性IMAT样本。

对snRNA-seq数据进行任何分析的第一步都是评估数据的质量,以识别质量较差的细胞核,这些细胞核可能会从数据集中删除。重要的是,应根据您手头的特定样本类型和数据集确定过滤步骤和阈值,因为通常评估的指?.......

Discussion

与IMAT合作存在一些固有的挑战。除了可及性有限外,样品材料的产量通常非常稀缺,骨骼肌的“污染”几乎是无法避免的。为了获得最高质量的样本,在插入活检针时应穿透肌肉筋膜(以确保不收集皮下脂肪组织),并在收集后立即在显微镜下解剖样本以去除尽可能多的肌肉组织,然后进行组织学处理、快速冷冻等。这是第一种利用从骨骼肌中前瞻性收集和解剖的IMAT样本的方法。相比之下,IMAT?.......

Acknowledgements

作者感谢科罗拉多大学的 Bryan Bergman 博士在图 1C 中提供了 MoTrIMAT 研究 (R01AG077956) 的 IMAT 活检图像。我们感谢肌肉、活动和衰老研究提供的 IMAT 样本,数据在代表性结果部分显示。美国国家老龄化研究所 (NIA) 资助了肌肉、活动性和衰老研究 (SOMMA;R01AG059416)及其辅助研究SOMMA AT(R01AG066474)和SOMMA膝关节OA (R01AG070647)。研究基础设施支持部分由匹兹堡大学 (P30AG024827) 和维克森林大学 (P30AG021332) 的 NIA Claude D. Pepper 老年美国独立中心以及临床和转化科学研究所资助,由维克森林大学国家促进转化科学中心 (UL1 0TR001420) 资助。

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm corning syringe filters Millipore SigmaCLS431229
1.7 mL DNA LoBind tubesEppendorf22431021low-bind tubes
10% Tween 20Bio-Rad1662404
100x protease inhibitorThermo Fisher Scientific78437
10X Magnetic Separator10X Genomics230003
10X Vortex Adapter10X Genomics330002
15 mL canonical tubesSarstedt6,25,54,502
2100 Bioanalyzer AgilentG2939BA
50 mL conical tubesSarstedt6,25,47,254
CellRangerGenomicsN/A
Chromium iX accesory kit10X GenomicsPN1000323
Chromium iX Controller10X GenomicsPN1000326
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit 10X GenomicsPN1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3'  Kit v 3.110X GenomicsPN1000269
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1 10X GenomicsPN1000129
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.110X GenomicsPN1000130
Countess 3 Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificAMQAX2000Automated cell counter
Countess cell counting chamber slidesThermo Fisher ScientificC10228
DoubletFinderN/A
DPBS (no calcium, no magnesium)Thermo Fisher Scientific14190144
DTTThermo Fisher ScientificR0861
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns10X GenomicsPN1000215
Dynabeads MyOne SILANE 10X GenomicsPN2000048
Falcon 100 µm Cell strainerCorning Life Science352360
Falcon 40 µm Cell strainerCorning Life Science352340
Glycerin (glycerol), 50% (v/v) Aqueous SolutionRicca Chemical Company3290-32
KCLThermo Fisher ScientificAM9640G
Library Construction Kit v3.110X GenomicsPN1000196
MACS SmartStrainers (30µm)Miltenyi Biotec130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cyclerEppendorf6331000017
MgCl2AmbionAM9530G
Mortar and pestelHealth care logistics 14075
NucBlue Live Ready Probes ReagentThermo Fisher ScientificR37605
Nuclease Free Water (not DEPC treated)Thermo Fisher ScientificAM9930
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, PowderSigma-Aldrich820024
Qiagen Buffer EBQiagen19086
Ribolock RNAse inhibitorThermo Fisher ScientificEO0382
SeuratN/A
SucroseSigma-AldrichS0389
SUPERasin 20 U/µLThermo Fisher ScientificAM2695
ThermoMixer CEppendorf 5382000015
Tissue homogenizerGlass-Col099C K54
Tris buffer pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
Triton X-100Thermo Fisher ScientificAC327372500
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0Gibco15575020

References

  1. Goodpaster, B. H., Bergman, B. C., Brennan, A. M., Sparks, L. M. Intermuscular adipose tissue in metabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 19 (5), 285-298 (2023).
  2. Sparks, L. M., Goodpaster, B. H., Bergman, B. C.

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