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由于人体组织的可及性有限,肌间脂肪组织 (IMAT) 的生物学在很大程度上尚未得到探索。在这里,我们提出了用于单核RNA测序的冷冻人IMAT的细胞核分离和文库制备的详细方案,以鉴定这种独特脂肪库的细胞组成。
肌间脂肪组织 (IMAT) 是一种相对未被充分研究的脂肪库,位于肌肉纤维之间。IMAT含量随着年龄和BMI的增加而增加,并与代谢和肌肉退行性疾病有关;然而,对IMAT的生物学特性及其与周围肌肉纤维的相互作用的理解严重缺乏。近年来,单细胞和细胞核RNA测序为我们提供了几种人体组织的细胞类型特异性图谱。然而,由于人类 IMAT 在活检采集中具有固有的挑战,因此人类 IMAT 的细胞组成在很大程度上仍未被探索。除了收集的组织数量有限外,由于人IMAT靠近骨骼肌组织和筋膜,因此其处理也很复杂。脂肪细胞的脂质含量使其与单细胞分离不相容。因此,单核RNA测序是获得单细胞分辨率高维转录组学的最佳方法,并有可能揭示该库的生物学特性,包括IMAT的确切细胞组成。在这里,我们提出了用于单核RNA测序的冷冻人IMAT的细胞核分离和文库制备的详细方案。该协议允许使用基于液滴的方法分析数千个细胞核,从而提供检测稀有和低丰度细胞类型的能力。
肌间脂肪组织 (IMAT) 是一种异位脂肪库,位于肌纤维之间和周围1。正如Goodpaster等人最近的一篇综述中详细描述的那样,IMAT可以使用高分辨率计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)来检测(图1A,B),并且可以在整个身体的肌肉纤维周围和内部发现1。IMAT的数量因人而异,并受BMI、年龄、性别、种族和久坐的影响2,3,4。此外,IMAT 沉积常见于与肌肉退化相关的病理状况5,许多研究记录了肥胖、2 型糖尿病、代谢综合征和胰岛素抵抗患者的 IMAT 质量增加 6,7,8,9。尽管如此,IMAT的细胞和生物学特性才刚刚开始被揭示。有限的可及性以及整个身体中 IMAT 位置和内容的变化,对从这种独特的脂肪库2
用于该协议的样本是肌肉、活动性和衰老研究 (SOMMA)15 的一部分,该研究由西方 IRB-哥白尼小组 (WCG) 机构审查委员会批准,并根据赫尔辛基宣言进行。参与者为参与研究提供了书面知情同意书。
注:该协议改编自先前的协议,在基于纳米孔的平台16上使用100mg人腹部皮下脂肪组织。当前方案针对 50 mg 人 IMAT 和使用基于液滴的平.......
该工作流程旨在指导冷冻人IMAT样品的处理,以获得单核分辨率的基因表达谱,从而实现细胞类型鉴定。在这里,展示了来自SOMMA研究参与者的一个代表性IMAT样本。
对snRNA-seq数据进行任何分析的第一步都是评估数据的质量,以识别质量较差的细胞核,这些细胞核可能会从数据集中删除。重要的是,应根据您手头的特定样本类型和数据集确定过滤步骤和阈值,因为通常评估的指?.......
与IMAT合作存在一些固有的挑战。除了可及性有限外,样品材料的产量通常非常稀缺,骨骼肌的“污染”几乎是无法避免的。为了获得最高质量的样本,在插入活检针时应穿透肌肉筋膜(以确保不收集皮下脂肪组织),并在收集后立即在显微镜下解剖样本以去除尽可能多的肌肉组织,然后进行组织学处理、快速冷冻等。这是第一种利用从骨骼肌中前瞻性收集和解剖的IMAT样本的方法。相比之下,IMAT?.......
作者感谢科罗拉多大学的 Bryan Bergman 博士在图 1C 中提供了 MoTrIMAT 研究 (R01AG077956) 的 IMAT 活检图像。我们感谢肌肉、活动和衰老研究提供的 IMAT 样本,数据在代表性结果部分显示。美国国家老龄化研究所 (NIA) 资助了肌肉、活动性和衰老研究 (SOMMA;R01AG059416)及其辅助研究SOMMA AT(R01AG066474)和SOMMA膝关节OA (R01AG070647)。研究基础设施支持部分由匹兹堡大学 (P30AG024827) 和维克森林大学 (P30AG021332) 的 NIA Claude D. Pepper 老年美国独立中心以及临床和转化科学研究所资助,由维克森林大学国家促进转化科学中心 (UL1 0TR001420) 资助。
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 µm corning syringe filters | Millipore Sigma | CLS431229 | |
1.7 mL DNA LoBind tubes | Eppendorf | 22431021 | low-bind tubes |
10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
100x protease inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78437 | |
10X Magnetic Separator | 10X Genomics | 230003 | |
10X Vortex Adapter | 10X Genomics | 330002 | |
15 mL canonical tubes | Sarstedt | 6,25,54,502 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
50 mL conical tubes | Sarstedt | 6,25,47,254 | |
CellRanger | Genomics | N/A | |
Chromium iX accesory kit | 10X Genomics | PN1000323 | |
Chromium iX Controller | 10X Genomics | PN1000326 | |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | PN1000127 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v 3.1 | 10X Genomics | PN1000269 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1 | 10X Genomics | PN1000129 | |
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.1 | 10X Genomics | PN1000130 | |
Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Automated cell counter |
Countess cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
DoubletFinder | R | N/A | |
DPBS (no calcium, no magnesium) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns | 10X Genomics | PN1000215 | |
Dynabeads MyOne SILANE | 10X Genomics | PN2000048 | |
Falcon 100 µm Cell strainer | Corning Life Science | 352360 | |
Falcon 40 µm Cell strainer | Corning Life Science | 352340 | |
Glycerin (glycerol), 50% (v/v) Aqueous Solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
KCL | Thermo Fisher Scientific | AM9640G | |
Library Construction Kit v3.1 | 10X Genomics | PN1000196 | |
MACS SmartStrainers (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cycler | Eppendorf | 6331000017 | |
MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
Mortar and pestel | Health care logistics | 14075 | |
NucBlue Live Ready Probes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
Nuclease Free Water (not DEPC treated) | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | Sigma-Aldrich | 820024 | |
Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
Ribolock RNAse inhibitor | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
Seurat | R | N/A | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
SUPERasin 20 U/µL | Thermo Fisher Scientific | AM2695 | |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Tissue homogenizer | Glass-Col | 099C K54 | |
Tris buffer pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | AC327372500 | |
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0 | Gibco | 15575020 |
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