A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
בידוד גרעינים מרקמת שומן בין-שרירית אנושית וריצוף RNA חד-גרעיני במורד הזרם
In This Article
Summary
הביולוגיה של רקמת השומן הבין-שרירית (IMAT) לא נחקרה במידה רבה בשל הנגישות המוגבלת של רקמת האדם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד גרעינים והכנת ספרייה של IMAT אנושי קפוא לריצוף RNA של גרעינים בודדים כדי לזהות את ההרכב התאי של מחסן שומן ייחודי זה.
Abstract
רקמת שומן בין-שרירית (IMAT) היא מחסן שומן לא נחקר יחסית הממוקם בין סיבי שריר. תוכן IMAT עולה עם הגיל וה- BMI וקשור למחלות מטבוליות וניווניות שרירים; עם זאת, הבנה של התכונות הביולוגיות של IMAT ויחסי הגומלין שלו עם סיבי השריר שמסביב חסרה מאוד. בשנים האחרונות, ריצוף RNA חד-תאי וגרעיני סיפק לנו אטלסים ספציפיים לסוג התא של מספר רקמות אנושיות. עם זאת, ההרכב התאי של IMAT אנושי נותר במידה רבה לא נחקר בשל האתגרים המובנים של נגישותו מאיסוף ביופסיה בבני אדם. בנוסף לכמות המוגבלת של רקמות שנאספות, עיבוד IMAT אנושי מסובך בשל קרבתו לרקמת שריר השלד והפאשיה. האופי עמוס השומנים של האדיפוציטים הופך אותו לבלתי תואם לבידוד של תא יחיד. לפיכך, ריצוף RNA של גרעינים בודדים הוא אופטימלי להשגת שעתוק ממדי גבוה ברזולוציה של תא בודד ומספק את הפוטנציאל לחשוף את הביולוגיה של מחסן זה, כולל ההרכב התאי המדויק של IMAT. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד גרעינים והכנת ספרייה של IMAT אנושי קפוא לריצוף RNA של גרעינים בודדים. פרוטוקול זה מאפשר יצירת פרופיל של אלפי גרעינים בגישה מבוססת טיפות, ובכך מספק את היכולת לזהות סוגי תאים נדירים ובעלי תפוצה נמוכה.
Introduction
רקמת שומן בין-שרירית (IMAT) היא מחסן שומן חוץ רחמי השוכן בין סיבי שרירוסביבם 1. כפי שתואר בפירוט בסקירה שנערכה לאחרונה על ידי Goodpaster et al., ניתן לזהות IMAT באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת ברזולוציה גבוהה (CT) והדמיית תהודה מגנטית (MRI) (איור 1A,B) והוא נמצא סביב ובתוך סיבי שריר בכל הגוף1. כמות ה- IMAT משתנה מאוד בין אנשים ומושפעת מ- BMI, גיל, מין, גזע וישיבה 2,3,4. יתר על כן, תצהיר IMAT נראה בדרך כלל במצבים פתולוגיים הקשורים לניוון שרירים5, ומחקרים רבים תיעדו ....
Protocol
הדגימה ששימשה לפרוטוקול זה הייתה חלק ממחקר השרירים, הניידות וההזדקנות (SOMMA)15, שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של Western IRB-Copernicus Group (WCG) ובוצע בהתאם להצהרת הלסינקי. המשתתפים סיפקו הסכמה מדעת בכתב להשתתפותם במחקר.
הערה: פרוטוקול זה מותאם מפרוטוקול קודם באמצ?.......
Representative Results
זרימת עבודה זו תוכננה להנחות את העיבוד של דגימות IMAT אנושיות קפואות כדי להשיג פרופילי ביטוי גנים ברזולוציית גרעינים יחידים, המאפשרים זיהוי סוג תא. כאן מוצג מדגם IMAT מייצג אחד ממשתתף במחקר SOMMA.
הצעד הראשון של כל ניתוח של נתוני snRNA-seq הוא להעריך את איכות הנתונים כדי לזהות גרעינים .......
Discussion
ישנם מספר אתגרים מובנים בעבודה עם IMAT. בנוסף לנגישותו המוגבלת, התפוקה של חומר הדגימה היא לעתים קרובות נדירה מאוד, וכמעט בלתי אפשרי להימנע מ"זיהום" של שרירי השלד. כדי לקבל את הדגימה האיכותית ביותר, יש לחדור לשריר הפאשיה בעת החדרת מחט הביופסיה (כדי להקפיד שלא לאסוף רקמת שומן תת עורית) ולהסיר כמ?.......
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לבריאן ברגמן, PhD מאוניברסיטת קולורדו על שסיפק את התמונה של ביופסיית IMAT באיור 1C ממחקר MoTrIMAT (R01AG077956). אנו אסירי תודה על מחקר השרירים, הניידות וההזדקנות המספק את מדגם IMAT שממנו מוצגים הנתונים בסעיף התוצאות המייצגות. המכון הלאומי להזדקנות (NIA) מימן את המחקר של שרירים, ניידות והזדקנות (SOMMA; R01AG059416) והמחקרים הנלווים שלה SOMMA AT (R01AG066474) ו- SOMMA Knee OA (R01AG070647). התמיכה בתשתית המחקר מומנה בחלקה על ידי NIA Claude D. Pepper Older American Independence Centers באוניברסיטת פיטסבורג (P30AG024827) ואוניברסיטת ווייק פורסט (P30AG021332) והמכונים למדע קליני ותרגומי, שמומנו על ידי המרכז הלאומי לקידום מדע תרגומי, באוניברסיטת ווייק ....
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm corning syringe filters | Millipore Sigma | CLS431229 | |
| 1.7 mL DNA LoBind tubes | Eppendorf | 22431021 | low-bind tubes |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100x protease inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78437 | |
| 10X Magnetic Separator | 10X Genomics | 230003 | |
| 10X Vortex Adapter | 10X Genomics | 330002 | |
| 15 mL canonical tubes | Sarstedt | 6,25,54,502 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | 6,25,47,254 | |
| CellRanger | Genomics | N/A | |
| Chromium iX accesory kit | 10X Genomics | PN1000323 | |
| Chromium iX Controller | 10X Genomics | PN1000326 | |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | PN1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v 3.1 | 10X Genomics | PN1000269 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1 | 10X Genomics | PN1000129 | |
| Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.1 | 10X Genomics | PN1000130 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Automated cell counter |
| Countess cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| DoubletFinder | R | N/A | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns | 10X Genomics | PN1000215 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10X Genomics | PN2000048 | |
| Falcon 100 µm Cell strainer | Corning Life Science | 352360 | |
| Falcon 40 µm Cell strainer | Corning Life Science | 352340 | |
| Glycerin (glycerol), 50% (v/v) Aqueous Solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| KCL | Thermo Fisher Scientific | AM9640G | |
| Library Construction Kit v3.1 | 10X Genomics | PN1000196 | |
| MACS SmartStrainers (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Mastercycler Nexus Gradient Thermal cycler | Eppendorf | 6331000017 | |
| MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
| Mortar and pestel | Health care logistics | 14075 | |
| NucBlue Live Ready Probes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Nuclease Free Water (not DEPC treated) | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | Sigma-Aldrich | 820024 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Ribolock RNAse inhibitor | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
| Seurat | R | N/A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SUPERasin 20 U/µL | Thermo Fisher Scientific | AM2695 | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| Tissue homogenizer | Glass-Col | 099C K54 | |
| Tris buffer pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | AC327372500 | |
| UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0 | Gibco | 15575020 |
References
- Goodpaster, B. H., Bergman, B. C., Brennan, A. M., Sparks, L. M. Intermuscular adipose tissue in metabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 19 (5), 285-298 (2023).
- Sparks, L. M., Goodpaster, B. H., Bergman, B. C.
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved