Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Биология межмышечной жировой ткани (IMAT) в значительной степени не изучена из-за ограниченной доступности тканей человека. Здесь мы представляем подробный протокол выделения ядер и подготовки библиотеки замороженного человеческого IMAT для секвенирования одноядерных РНК для определения клеточного состава этого уникального жирового депо.

Abstract

Межмышечная жировая ткань (IMAT) – это относительно малоизученное жировое депо, расположенное между мышечными волокнами. Содержание IMAT увеличивается с возрастом и ИМТ и связано с метаболическими и мышечными дегенеративными заболеваниями; однако понимание биологических свойств IMAT и его взаимодействия с окружающими мышечными волокнами сильно отсутствует. В последние годы секвенирование одиночных клеток и ядер РНК позволило нам получить атласы нескольких тканей человека, специфичные для разных типов клеток. Тем не менее, клеточный состав IMAT человека остается в значительной степени неизученным из-за неотъемлемых проблем, связанных с его доступностью из биопсии у человека. В дополнение к ограниченному количеству собранной ткани, обработка IMAT человека затруднена из-за его близости к скелетной мышечной ткани и фасциям. Насыщенная липидами природа адипоцитов делает его несовместимым с выделением одиночных клеток. Следовательно, секвенирование РНК с одним ядром является оптимальным для получения многомерной транскриптомики с разрешением одной клетки и обеспечивает потенциал для раскрытия биологии этого депо, включая точный клеточный состав IMAT. Здесь мы представляем подробный протокол выделения ядер и подготовки библиотеки замороженного человеческого IMAT для секвенирования одноядерных РНК. Этот протокол позволяет профилировать тысячи ядер с использованием капельного подхода, тем самым обеспечивая возможность обнаружения редких и малораспространенных типов клеток.

Introduction

Межмышечная жировая ткань (IMAT) представляет собой эктопическое жировое депо, расположенное между мышечными волокнами и вокруг них1. Как подробно описано в недавнем обзоре Goodpaster et al., IMAT может быть обнаружен с помощью компьютерной томографии (КТ) высокого разрешения и магнитно-резонансной томографии (МРТ) (рис. 1A, B) и обнаруживается вокруг и внутри мышечных волокон повсему телу. Количество IMAT сильно варьируется у разных людей и зависит от ИМТ, возраста, пола, расы и сидячего образа жизни 2,3,4

Protocol

Образец, использованный для этого протокола, был частью Исследования мышц, подвижности и старения (SOMMA)15, которое было одобрено Институциональным наблюдательным советом Западной группы IRB-Copernicus (WCG) и проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией. Участники п?.......

Representative Results

Этот рабочий процесс был разработан для управления обработкой замороженных образцов IMAT человека для получения профилей экспрессии генов с разрешением одного ядра, что позволяет идентифицировать тип клеток. Здесь представлена одна репрезентативная выборка IMAT от участника исследован.......

Discussion

Работа с IMAT сопряжена с несколькими проблемами. Помимо ограниченной доступности, выход материала образца часто бывает очень скудным, а «загрязнения» скелетных мышц практически невозможно избежать. Для получения образца наилучшего качества следует проникнуть в мышечную фасцию при вв?.......

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

Авторы выражают признательность Брайану Бергману, доктору философии из Университета Колорадо, за предоставление изображения биопсии IMAT на рисунке 1C из исследования MoTrIMAT (R01AG077956). Мы благодарны Study of Muscle, Mobility and Aging (Study of Muscle, Mobility and Aging) предоставила выборку IMAT, данные которой представлены в разделе репрезентативных результатов. Национальный институт по проблемам старения (NIA) финансировал исследование мышц, подвижности и старения (SOMMA; R01AG059416) и его вспомогательные исследования SOMMA AT (R01AG066474) и SOMMA Knee OA (R01AG070647). Поддержка исследовательской инфраструктуры частично финансировалась Центрами независимо....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm corning syringe filters Millipore SigmaCLS431229
1.7 mL DNA LoBind tubesEppendorf22431021low-bind tubes
10% Tween 20Bio-Rad1662404
100x protease inhibitorThermo Fisher Scientific78437
10X Magnetic Separator10X Genomics230003
10X Vortex Adapter10X Genomics330002
15 mL canonical tubesSarstedt6,25,54,502
2100 Bioanalyzer AgilentG2939BA
50 mL conical tubesSarstedt6,25,47,254
CellRangerGenomicsN/A
Chromium iX accesory kit10X GenomicsPN1000323
Chromium iX Controller10X GenomicsPN1000326
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit 10X GenomicsPN1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3'  Kit v 3.110X GenomicsPN1000269
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1 10X GenomicsPN1000129
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.110X GenomicsPN1000130
Countess 3 Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificAMQAX2000Automated cell counter
Countess cell counting chamber slidesThermo Fisher ScientificC10228
DoubletFinderN/A
DPBS (no calcium, no magnesium)Thermo Fisher Scientific14190144
DTTThermo Fisher ScientificR0861
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns10X GenomicsPN1000215
Dynabeads MyOne SILANE 10X GenomicsPN2000048
Falcon 100 µm Cell strainerCorning Life Science352360
Falcon 40 µm Cell strainerCorning Life Science352340
Glycerin (glycerol), 50% (v/v) Aqueous SolutionRicca Chemical Company3290-32
KCLThermo Fisher ScientificAM9640G
Library Construction Kit v3.110X GenomicsPN1000196
MACS SmartStrainers (30µm)Miltenyi Biotec130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cyclerEppendorf6331000017
MgCl2AmbionAM9530G
Mortar and pestelHealth care logistics 14075
NucBlue Live Ready Probes ReagentThermo Fisher ScientificR37605
Nuclease Free Water (not DEPC treated)Thermo Fisher ScientificAM9930
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, PowderSigma-Aldrich820024
Qiagen Buffer EBQiagen19086
Ribolock RNAse inhibitorThermo Fisher ScientificEO0382
SeuratN/A
SucroseSigma-AldrichS0389
SUPERasin 20 U/µLThermo Fisher ScientificAM2695
ThermoMixer CEppendorf 5382000015
Tissue homogenizerGlass-Col099C K54
Tris buffer pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
Triton X-100Thermo Fisher ScientificAC327372500
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0Gibco15575020

References

  1. Goodpaster, B. H., Bergman, B. C., Brennan, A. M., Sparks, L. M. Intermuscular adipose tissue in metabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 19 (5), 285-298 (2023).
  2. Sparks, L. M., Goodpaster, B. H., Bergman, B. C.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

IMAT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved