Выделение ядер из межмышечной жировой ткани человека и последующее секвенирование одноядерных РНК

Summary

Биология межмышечной жировой ткани (IMAT) в значительной степени не изучена из-за ограниченной доступности тканей человека. Здесь мы представляем подробный протокол выделения ядер и подготовки библиотеки замороженного человеческого IMAT для секвенирования одноядерных РНК для определения клеточного состава этого уникального жирового депо.

Abstract

Межмышечная жировая ткань (IMAT) – это относительно малоизученное жировое депо, расположенное между мышечными волокнами. Содержание IMAT увеличивается с возрастом и ИМТ и связано с метаболическими и мышечными дегенеративными заболеваниями; однако понимание биологических свойств IMAT и его взаимодействия с окружающими мышечными волокнами сильно отсутствует. В последние годы секвенирование одиночных клеток и ядер РНК позволило нам получить атласы нескольких тканей человека, специфичные для разных типов клеток. Тем не менее, клеточный состав IMAT человека остается в значительной степени неизученным из-за неотъемлемых проблем, связанных с его доступностью из биопсии у человека. В дополнение к ограниченному количеству собранной ткани, обработка IMAT человека затруднена из-за его близости к скелетной мышечной ткани и фасциям. Насыщенная липидами природа адипоцитов делает его несовместимым с выделением одиночных клеток. Следовательно, секвенирование РНК с одним ядром является оптимальным для получения многомерной транскриптомики с разрешением одной клетки и обеспечивает потенциал для раскрытия биологии этого депо, включая точный клеточный состав IMAT. Здесь мы представляем подробный протокол выделения ядер и подготовки библиотеки замороженного человеческого IMAT для секвенирования одноядерных РНК. Этот протокол позволяет профилировать тысячи ядер с использованием капельного подхода, тем самым обеспечивая возможность обнаружения редких и малораспространенных типов клеток.

Introduction

Межмышечная жировая ткань (IMAT) представляет собой эктопическое жировое депо, расположенное между мышечными волокнами и вокруг них¹. Как подробно описано в недавнем обзоре Goodpaster et al., IMAT может быть обнаружен с помощью компьютерной томографии (КТ) высокого разрешения и магнитно-резонансной томографии (МРТ) (рис. 1A, B) и обнаруживается вокруг и внутри мышечных волокон по^{всему телу}. Количество IMAT сильно варьируется у разных людей и зависит от ИМТ, возраста, пола, расы и сидячего образа жизни ^2,3,4

Protocol

Образец, использованный для этого протокола, был частью Исследования мышц, подвижности и старения (SOMMA)^15, которое было одобрено Институциональным наблюдательным советом Западной группы IRB-Copernicus (WCG) и проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией. Участники п?.......

Discussion

Работа с IMAT сопряжена с несколькими проблемами. Помимо ограниченной доступности, выход материала образца часто бывает очень скудным, а «загрязнения» скелетных мышц практически невозможно избежать. Для получения образца наилучшего качества следует проникнуть в мышечную фасцию при вв?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm corning syringe filters	Millipore Sigma	CLS431229
1.7 mL DNA LoBind tubes	Eppendorf	22431021	low-bind tubes
10% Tween 20	Bio-Rad	1662404
100x protease inhibitor	Thermo Fisher Scientific	78437
10X Magnetic Separator	10X Genomics	230003
10X Vortex Adapter	10X Genomics	330002
15 mL canonical tubes	Sarstedt	6,25,54,502
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA
50 mL conical tubes	Sarstedt	6,25,47,254
CellRanger	Genomics	N/A
Chromium iX accesory kit	10X Genomics	PN1000323
Chromium iX Controller	10X Genomics	PN1000326
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit	10X Genomics	PN1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3'  Kit v 3.1	10X Genomics	PN1000269
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1	10X Genomics	PN1000129
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.1	10X Genomics	PN1000130
Countess 3 Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX2000	Automated cell counter
Countess cell counting chamber slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
DoubletFinder	R	N/A
DPBS (no calcium, no magnesium)	Thermo Fisher Scientific	14190144
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns	10X Genomics	PN1000215
Dynabeads MyOne SILANE	10X Genomics	PN2000048
Falcon 100 µm Cell strainer	Corning Life Science	352360
Falcon 40 µm Cell strainer	Corning Life Science	352340
Glycerin (glycerol), 50% (v/v) Aqueous Solution	Ricca Chemical Company	3290-32
KCL	Thermo Fisher Scientific	AM9640G
Library Construction Kit v3.1	10X Genomics	PN1000196
MACS SmartStrainers (30µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cycler	Eppendorf	6331000017
MgCl2	Ambion	AM9530G
Mortar and pestel	Health care logistics	14075
NucBlue Live Ready Probes Reagent	Thermo Fisher Scientific	R37605
Nuclease Free Water (not DEPC treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9930
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder	Sigma-Aldrich	820024
Qiagen Buffer EB	Qiagen	19086
Ribolock RNAse inhibitor	Thermo Fisher Scientific	EO0382
Seurat	R	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
SUPERasin 20 U/µL	Thermo Fisher Scientific	AM2695
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000015
Tissue homogenizer	Glass-Col	099C K54
Tris buffer pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	AM9855G
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	AC327372500
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0	Gibco	15575020