A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Биология межмышечной жировой ткани (IMAT) в значительной степени не изучена из-за ограниченной доступности тканей человека. Здесь мы представляем подробный протокол выделения ядер и подготовки библиотеки замороженного человеческого IMAT для секвенирования одноядерных РНК для определения клеточного состава этого уникального жирового депо.
Межмышечная жировая ткань (IMAT) – это относительно малоизученное жировое депо, расположенное между мышечными волокнами. Содержание IMAT увеличивается с возрастом и ИМТ и связано с метаболическими и мышечными дегенеративными заболеваниями; однако понимание биологических свойств IMAT и его взаимодействия с окружающими мышечными волокнами сильно отсутствует. В последние годы секвенирование одиночных клеток и ядер РНК позволило нам получить атласы нескольких тканей человека, специфичные для разных типов клеток. Тем не менее, клеточный состав IMAT человека остается в значительной степени неизученным из-за неотъемлемых проблем, связанных с его доступностью из биопсии у человека. В дополнение к ограниченному количеству собранной ткани, обработка IMAT человека затруднена из-за его близости к скелетной мышечной ткани и фасциям. Насыщенная липидами природа адипоцитов делает его несовместимым с выделением одиночных клеток. Следовательно, секвенирование РНК с одним ядром является оптимальным для получения многомерной транскриптомики с разрешением одной клетки и обеспечивает потенциал для раскрытия биологии этого депо, включая точный клеточный состав IMAT. Здесь мы представляем подробный протокол выделения ядер и подготовки библиотеки замороженного человеческого IMAT для секвенирования одноядерных РНК. Этот протокол позволяет профилировать тысячи ядер с использованием капельного подхода, тем самым обеспечивая возможность обнаружения редких и малораспространенных типов клеток.
Межмышечная жировая ткань (IMAT) представляет собой эктопическое жировое депо, расположенное между мышечными волокнами и вокруг них1. Как подробно описано в недавнем обзоре Goodpaster et al., IMAT может быть обнаружен с помощью компьютерной томографии (КТ) высокого разрешения и магнитно-резонансной томографии (МРТ) (рис. 1A, B) и обнаруживается вокруг и внутри мышечных волокон повсему телу. Количество IMAT сильно варьируется у разных людей и зависит от ИМТ, возраста, пола, расы и сидячего образа жизни 2,3,4
Образец, использованный для этого протокола, был частью Исследования мышц, подвижности и старения (SOMMA)15, которое было одобрено Институциональным наблюдательным советом Западной группы IRB-Copernicus (WCG) и проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией. Участники п?.......
Этот рабочий процесс был разработан для управления обработкой замороженных образцов IMAT человека для получения профилей экспрессии генов с разрешением одного ядра, что позволяет идентифицировать тип клеток. Здесь представлена одна репрезентативная выборка IMAT от участника исследован.......
Работа с IMAT сопряжена с несколькими проблемами. Помимо ограниченной доступности, выход материала образца часто бывает очень скудным, а «загрязнения» скелетных мышц практически невозможно избежать. Для получения образца наилучшего качества следует проникнуть в мышечную фасцию при вв?.......
Авторы выражают признательность Брайану Бергману, доктору философии из Университета Колорадо, за предоставление изображения биопсии IMAT на рисунке 1C из исследования MoTrIMAT (R01AG077956). Мы благодарны Study of Muscle, Mobility and Aging (Study of Muscle, Mobility and Aging) предоставила выборку IMAT, данные которой представлены в разделе репрезентативных результатов. Национальный институт по проблемам старения (NIA) финансировал исследование мышц, подвижности и старения (SOMMA; R01AG059416) и его вспомогательные исследования SOMMA AT (R01AG066474) и SOMMA Knee OA (R01AG070647). Поддержка исследовательской инфраструктуры частично финансировалась Центрами независимо....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 µm corning syringe filters | Millipore Sigma | CLS431229 | |
1.7 mL DNA LoBind tubes | Eppendorf | 22431021 | low-bind tubes |
10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
100x protease inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78437 | |
10X Magnetic Separator | 10X Genomics | 230003 | |
10X Vortex Adapter | 10X Genomics | 330002 | |
15 mL canonical tubes | Sarstedt | 6,25,54,502 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
50 mL conical tubes | Sarstedt | 6,25,47,254 | |
CellRanger | Genomics | N/A | |
Chromium iX accesory kit | 10X Genomics | PN1000323 | |
Chromium iX Controller | 10X Genomics | PN1000326 | |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | PN1000127 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v 3.1 | 10X Genomics | PN1000269 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1 | 10X Genomics | PN1000129 | |
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.1 | 10X Genomics | PN1000130 | |
Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Automated cell counter |
Countess cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
DoubletFinder | R | N/A | |
DPBS (no calcium, no magnesium) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns | 10X Genomics | PN1000215 | |
Dynabeads MyOne SILANE | 10X Genomics | PN2000048 | |
Falcon 100 µm Cell strainer | Corning Life Science | 352360 | |
Falcon 40 µm Cell strainer | Corning Life Science | 352340 | |
Glycerin (glycerol), 50% (v/v) Aqueous Solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
KCL | Thermo Fisher Scientific | AM9640G | |
Library Construction Kit v3.1 | 10X Genomics | PN1000196 | |
MACS SmartStrainers (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cycler | Eppendorf | 6331000017 | |
MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
Mortar and pestel | Health care logistics | 14075 | |
NucBlue Live Ready Probes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
Nuclease Free Water (not DEPC treated) | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | Sigma-Aldrich | 820024 | |
Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
Ribolock RNAse inhibitor | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
Seurat | R | N/A | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
SUPERasin 20 U/µL | Thermo Fisher Scientific | AM2695 | |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Tissue homogenizer | Glass-Col | 099C K54 | |
Tris buffer pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | AC327372500 | |
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0 | Gibco | 15575020 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved