Construção de um modelo ortotópico de xenoenxerto de câncer de pulmão de células não pequenas imitando a progressão da doença e prevendo atividades medicamentosas

Summary

Este estudo apresenta um modelo ortotópico de câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) baseado na inoculação intrapulmonar de esferoides multicelulares de células fluorescentes A549-iRFP. O modelo recapitula os estágios clínicos do NSCLC e responde à cisplatina, de acordo com o monitoramento dinâmico in vivo da fluorescência de comprimento de onda longo.

Abstract

O câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) é uma doença altamente letal com um microambiente tumoral complexo e heterogêneo. Atualmente, modelos animais comuns baseados na inoculação subcutânea de suspensões de células cancerígenas não recapitulam o microambiente tumoral no NSCLC. Descrevemos aqui um modelo de xenoenxerto de câncer de pulmão ortotópico murino que emprega a inoculação intrapulmonar de esferoides multicelulares tridimensionais (MCS). Especificamente, células fluorescentes de NSCLC humano (A549-iRFP) foram cultivadas em microplacas de 96 poços de baixa fixação com colágeno por 3 semanas para formar MCS, que foram então inoculadas intercostalmente no pulmão esquerdo de camundongos nus atímicos para estabelecer o modelo ortotópico de câncer de pulmão.

Em comparação com a linha celular A549 original, o MCS da linha celular A549-iRFP respondeu de forma semelhante aos medicamentos anticâncer. O sinal fluorescente de comprimento de onda longo das células A549-iRFP correlacionou-se fortemente com marcadores comuns de crescimento de células cancerígenas, incluindo volume esferóide, viabilidade celular e nível de proteína celular, permitindo assim o monitoramento dinâmico do crescimento do câncer in vivo por imagens fluorescentes. Após a inoculação em camundongos, o xenoenxerto A549-iRFP MCS progrediu de forma confiável através de fases muito semelhantes aos estágios clínicos do NSCLC, incluindo a expansão do tumor primário, o surgimento de tumores secundários vizinhos e as metástases de células cancerígenas para o pulmão direito contralateral e órgãos remotos. Além disso, o modelo respondeu ao medicamento anticâncer de pulmão de referência, a cisplatina, com a toxicidade antecipada e a progressão mais lenta do câncer. Portanto, este modelo de xenoenxerto ortotópico murino de NSCLC serviria como uma plataforma para recapitular a progressão da doença e facilitar o desenvolvimento de potenciais drogas anticancerígenas.

Introduction

Entre todos os distúrbios oncológicos, o câncer de pulmão não apenas inflige a maior perda de vidas, mas também reivindica o segundo maior número de novos pacientes a cada ano nos EUA¹. Essa malignidade devastadora é um grande obstáculo na saúde moderna, exigindo uma compreensão mais profunda de sua intrincada biologia e modalidades terapêuticas mais eficazes². O câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) é responsável por 85% dos cânceres de pulmão e tende a evoluir para tumores sólidos³. Um dos principais desafios do câncer de pulmão é o microambiente tumoral dinâmico e heterogêneo, que in....

Protocol

O estudo em animais foi realizado com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade do Pacífico (Protocolos Animais 19R10 e 22R10). Oito camundongos machos atímicos nus com idade entre 5 e 6 semanas, pesando 20 a 25 g, criados com a dieta de roedores referenciada e alojados em condições livres de patógenos (FPS), foram usados para o presente estudo. Gaiolas, roupas de cama e água potável foram autoclavadas e trocadas regularmente. Um esquema de inoculação de tumor em.......

Discussion

A construção do A549-iRFP MCS é um procedimento laboratorial simples e altamente reprodutível e pode ser traduzido para a formação de MCS para várias linhagens celulares. O MCS gerado com o auxílio de centrifugação e colágeno exibe uma estrutura mais integral e semelhante a um tumor sólido em 3-4 dias. Este método garante a formação de esferóides robustos que mantêm sua estrutura integral por longos períodos, normalmente 2-3 semanas ou até mais até que pequenos brotos comecem a surgir. Empregando cent.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 µL Glass Syringe	Hamilton	Part/REF #80601
20 G Needle	Thermo Fisher Scientific Inc.	14 826D
96-well Ultra-Low-Attachment Spheroid Microplate	Corning	15-100-173
A549-iRFP	Imanis Life Sciences	CL082-STAN
AIN-93M Mature Rodent Diet	Research Diets, Inc.	D10012M
Athymic Nude Mouse	Charles River Laboratories, Inc.	Strain Code: 490; homozygous
BCA	Pierce	23227
Buprenorphine Hydrochloride	Patterson Veterinary	NDC Number: 42023-179-05
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9683
Collagen	Gibco	A1064401
DMEM	Corning	MT10013CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva HyClone	SH3039603
ImageJ	Open source tool (https://imagej.net/ij/)	N/A
Image Studio	LI-COR	Version 5.2
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC Number: 17033-0091-25
Ketamine	Patterson Veterinary	NDC Number: 50989-0161-06
Microscope	Keyence	Model number: BZ-X710
Matrigel	Corning	CB-40234
Odyssey Infrared Imaging 205 System	LI-COR	Model number: 9140
PBS	Corning	MT21040CV
Pearl Trilogy small animal imaging system	LI-COR	Model number: 9430
Penicillin-Streptomycin	Corning	MT30002CI
Puromycin	Thermo Fisher Scientific Inc.	AAJ67236XF
ReViSP software from MATLAB	Open source tool on Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)	N/A
Surgical Clips--AutoClip System	Fine Science Tools	12020-00
Xylazine	Patterson Veterinary	NDC Number: 61133-6017-01