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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este estudo apresenta um modelo ortotópico de câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) baseado na inoculação intrapulmonar de esferoides multicelulares de células fluorescentes A549-iRFP. O modelo recapitula os estágios clínicos do NSCLC e responde à cisplatina, de acordo com o monitoramento dinâmico in vivo da fluorescência de comprimento de onda longo.

Abstract

O câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) é uma doença altamente letal com um microambiente tumoral complexo e heterogêneo. Atualmente, modelos animais comuns baseados na inoculação subcutânea de suspensões de células cancerígenas não recapitulam o microambiente tumoral no NSCLC. Descrevemos aqui um modelo de xenoenxerto de câncer de pulmão ortotópico murino que emprega a inoculação intrapulmonar de esferoides multicelulares tridimensionais (MCS). Especificamente, células fluorescentes de NSCLC humano (A549-iRFP) foram cultivadas em microplacas de 96 poços de baixa fixação com colágeno por 3 semanas para formar MCS, que foram então inoculadas intercostalmente no pulmão esquerdo de camundongos nus atímicos para estabelecer o modelo ortotópico de câncer de pulmão.

Em comparação com a linha celular A549 original, o MCS da linha celular A549-iRFP respondeu de forma semelhante aos medicamentos anticâncer. O sinal fluorescente de comprimento de onda longo das células A549-iRFP correlacionou-se fortemente com marcadores comuns de crescimento de células cancerígenas, incluindo volume esferóide, viabilidade celular e nível de proteína celular, permitindo assim o monitoramento dinâmico do crescimento do câncer in vivo por imagens fluorescentes. Após a inoculação em camundongos, o xenoenxerto A549-iRFP MCS progrediu de forma confiável através de fases muito semelhantes aos estágios clínicos do NSCLC, incluindo a expansão do tumor primário, o surgimento de tumores secundários vizinhos e as metástases de células cancerígenas para o pulmão direito contralateral e órgãos remotos. Além disso, o modelo respondeu ao medicamento anticâncer de pulmão de referência, a cisplatina, com a toxicidade antecipada e a progressão mais lenta do câncer. Portanto, este modelo de xenoenxerto ortotópico murino de NSCLC serviria como uma plataforma para recapitular a progressão da doença e facilitar o desenvolvimento de potenciais drogas anticancerígenas.

Introduction

Entre todos os distúrbios oncológicos, o câncer de pulmão não apenas inflige a maior perda de vidas, mas também reivindica o segundo maior número de novos pacientes a cada ano nos EUA1. Essa malignidade devastadora é um grande obstáculo na saúde moderna, exigindo uma compreensão mais profunda de sua intrincada biologia e modalidades terapêuticas mais eficazes2. O câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) é responsável por 85% dos cânceres de pulmão e tende a evoluir para tumores sólidos3. Um dos principais desafios do câncer de pulmão é o microambiente tumoral dinâmico e heterogêneo, que in....

Protocol

O estudo em animais foi realizado com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade do Pacífico (Protocolos Animais 19R10 e 22R10). Oito camundongos machos atímicos nus com idade entre 5 e 6 semanas, pesando 20 a 25 g, criados com a dieta de roedores referenciada e alojados em condições livres de patógenos (FPS), foram usados para o presente estudo. Gaiolas, roupas de cama e água potável foram autoclavadas e trocadas regularmente. Um esquema de inoculação de tumor em.......

Representative Results

Caracterização do A549-iRFP MCS
Os MCS A549-iRFP foram cultivados com sucesso em microplacas esferóides com a ajuda de colágeno e centrifugação. Quando o MCS atingiu um diâmetro de aproximadamente 500 μm após 1 semana, tanto o A549 quanto o A549-iRFP MCS foram expostos a uma variedade de medicamentos e formulações anticâncer por 3 dias e depois mantidos em meio de crescimento livre de medicamentos por 4 dias adicionais. O A549-iRFP MCS exibiu um padrão de resposta que espelha de perto o d.......

Discussion

A construção do A549-iRFP MCS é um procedimento laboratorial simples e altamente reprodutível e pode ser traduzido para a formação de MCS para várias linhagens celulares. O MCS gerado com o auxílio de centrifugação e colágeno exibe uma estrutura mais integral e semelhante a um tumor sólido em 3-4 dias. Este método garante a formação de esferóides robustos que mantêm sua estrutura integral por longos períodos, normalmente 2-3 semanas ou até mais até que pequenos brotos comecem a surgir. Empregando cent.......

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por bolsas SAAG e SEED da Universidade do Pacífico. Agradecemos ao Dr. William Chan por conceder acesso ao Sistema de Imagem Infravermelha Odyssey 205 e ao Dr. John Livesey por conceder acesso ao leitor de placas SpectraMax iD3. Agradecemos à Dra. Melanie Felmlee pelo aconselhamento técnico sobre os protocolos animais.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 µL Glass SyringeHamiltonPart/REF #80601
20 G NeedleThermo Fisher Scientific Inc.14 826D
96-well Ultra-Low-Attachment Spheroid Microplate Corning15-100-173
A549-iRFPImanis Life Sciences CL082-STAN
AIN-93M Mature Rodent Diet Research Diets, Inc.D10012M
Athymic Nude MouseCharles River Laboratories, Inc.Strain Code: 490; homozygous
BCAPierce23227
Buprenorphine HydrochloridePatterson VeterinaryNDC Number: 42023-179-05
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromegaG9683
CollagenGibcoA1064401 
DMEMCorningMT10013CV
Fetal Bovine Serum (FBS)Cytiva HyCloneSH3039603
ImageJOpen source tool (https://imagej.net/ij/)N/A
Image Studio LI-CORVersion 5.2
IsofluranePatterson VeterinaryNDC Number: 17033-0091-25
KetaminePatterson VeterinaryNDC Number: 50989-0161-06
Microscope KeyenceModel number: BZ-X710
MatrigelCorningCB-40234
Odyssey Infrared Imaging 205 System LI-CORModel number: 9140
PBSCorningMT21040CV
Pearl Trilogy small animal imaging system LI-CORModel number: 9430
Penicillin-Streptomycin CorningMT30002CI
PuromycinThermo Fisher Scientific Inc.AAJ67236XF
ReViSP software from MATLAB Open source tool on Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)N/A
Surgical Clips--AutoClip SystemFine Science Tools12020-00
XylazinePatterson VeterinaryNDC Number: 61133-6017-01

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).
  2. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers....

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Palavras chave Xenoenxerto ortot picoc ncer de pulm o de c lulas n o pequenasesferoides multicelularesc lulas A549 iRFPmicroambiente tumoralprogress o do c ncerteste de drogasimagem fluorescente

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