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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

我们证明了化学诱导小鼠大血管扩张作为研究脑血管功能障碍的模型,可用于血管性痴呆和阿尔茨海默病建模。我们还演示了通过注射硅橡胶化合物来可视化脉管系统,并为测量血管大小的变化提供清晰的视觉指导。

Abstract

血脑 (BBB) 是一个重要的系统,它调节与外围的选择性大脑循环,例如,允许必要的营养物质进入并从大脑中排出过多的氨基酸或毒素。 为了模拟 BBB 在血管性痴呆 (VaD) 或阿尔茨海默病 (AD) 等疾病中如何受损,研究人员开发了模拟血管扩张的新方法。在这些疾病状态下,受损的 BBB 可能是有害的,并导致 BBB 失调,从而导致影响大脑功能的不良和病理后果。我们能够修改一种现有技术,使我们能够直接注射到大脑池 (CM) 中,以使用弹性蛋白酶诱导血管扩张,并破坏 BBB 的紧密连接 (TJ)。使用这种方法,我们能够看到与以前技术相比的各种成功指标,包括一致的血管扩张、降低死亡率或提高恢复率,以及改进填充剂/遮光剂(一种硅橡胶化合物)用于标记血管以进行扩张分析的递送。这种改进的微创方法取得了可喜的结果,注射后 2 周至 3 个月小鼠大血管的持续扩张增加了 19%-32%。这种改善与以前的研究形成鲜明对比,以前的研究显示仅在 2 周标记时扩张增加。其他数据表明,即使在 9.5 个月后,该病仍持续扩张。通过比较弹性蛋白酶和载体注射组的血管直径来证实这种增加。总体而言,这项技术对于使用动物模型研究影响中枢神经系统 (CNS) 的病理疾病很有价值。

Introduction

排列在脑毛细血管上的微血管内皮细胞是形成血脑屏障 (BBB)1 的主要成分,该屏障在调节进出外周大脑循环的物质方面起着至关重要的作用。神经组织所需的必需营养素被允许进入 BBB,而一些必需氨基酸(如谷氨酸)被从大脑中排出,因为高浓度会对脑组织造成永久性的神经兴奋性损伤2。在正常生理条件下,BBB 限制了白蛋白 3,4 和凝血酶原等血浆蛋白的数量进入大脑,因为它们可能会产生有害影响 5,6,7最后,BBB 保护大脑免受外周循环的神经毒素的侵害,例如食物或环境中的外源性物质1。总体而言,对脑组织的损伤是不可逆的,与低水平神经发生8 相关的衰老突出了 BBB 在保护和防止任何因素加速神经退行性过程方面的重要性。

在多脂扩张症(或大血管扩张)中,观察到血管弹性降低,这导致血管发生形态变化,从而使它们功能失调9 并导致大脑中的血流减少。这种血流量的....

Protocol

本研究使用在生理水平上表达人淀粉样蛋白斑块的 AppNL-F小鼠 (3 个月大),尽管该系统可用于任何啮齿动物模型。所有动物程序均已获得 CAMH 动物护理委员会(协议 #843)的批准,并符合加拿大动物护理委员会指南的道德标准。小鼠在内部饲养并保持 12 小时的明暗循环, 随意 获取食物和水。

1. 大脑池 (CM) 注射程序

  1. 手术
    1. 将小鼠(A.......

Representative Results

在小心地将鼠标放在立体定位框架上并解剖肌肉后,我们成功地在颅骨枕部区域下方找到了 Cisterna magna。这种解剖结构类似于一个倒三角形并以黄色突出显示,位于颅底下方(图 1)。为确保精度并防止对脑组织造成任何损伤,将 1-2 mm 的 Hamilton 注射器斜面轻轻插入 Cisterna magna。

弹性蛋白酶注射后,以三个不同的时间间隔用 PBS 和 4% PFA 灌注动物:2 周、.......

Discussion

本文展示了一种改进的脑血管扩张方案,为将弹性蛋白酶注射到小鼠的大脑池中提供了一种精确而直接的方法。这个解剖点是通往脑脊液的直接门户,为研究不同的神经系统疾病提供了宝贵的途径。这种改良技术的主要优点之一是,将单剂量的弹性蛋白酶注射到小鼠的大脑池中能够引起并维持大血管扩张至少 3 个月,而无需重复注射或植入套管。将弹性蛋白酶施用到 AD 小鼠模型中的方法是另一个.......

Disclosures

没有利益冲突。

Acknowledgements

这项研究得益于 Stephanie Tam 的宝贵贡献,她为协助手术提供了支持。我们对她的帮助表示衷心的感谢。美国国立卫生研究院 (AG066162) 支持这项研究。

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
23 G catheterUniversity Medstore2546-CABD305145Needed for perfusion  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Absolute ethanolUniversity Medstorehttps://www.uoftmedstore.com/index.szFor removing the microfil
Betadine scrub#https://www.pittsborofeed.com/products/betadine-surgical-scrubSterilization
Betadine solutionAmazonhttps://www.amazon.ca/Povidone-Iodine-10-Topical-Solution-100ml/dp/B09DTKJGHWSterilization
BupivacaineProvided by animal facilityN/AAnalgesic
ClippersBrainTree Scientific IncCLP-41590Shave fur
Cotton Q-tipUniversity Medstore1962For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
ElastaseSigma-aldrich E7885Used for the dilatation of blood vessel
EthanolUniversity Medstore39752-P016-EAANSterilization (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Goat anti-mouse 568InvitrogenA11004For staining mature neurons
Graphpad prism 10Graphpad prism 10https://www.graphpad.com/Statistical analysis software
Hamilton syringeSigma-aldrich28614-UInjection elastase
Heat padAmazonhttps://www.amazon.ca/iPower-Temperature-Controller-Terrarium-Amphibians/dp/B08L4DBFFZMaintain body temperature
ImageJ softwareFiji Imagej softwareimagej.net (USA)Image analysis software
Induction chamberProvided by animal facilityN/AAnesthesia induction
MetacamProvided by animal facilityN/AAnalgesic
Methyl salicylateSigma-aldrichM6752For removing the microfil
MicrofilFlow Tech, Carver, Massachusettshttps://www.flowtech-inc.com/order/ Dye (yellow)
Mouse monoclonal anti-NeuNMillipore SigmaMAB377For staining mature neurons
Olympus VS200 slide scanner and VSI software.Olympus Life Sciencehttps://www.olympus-lifescience.com/en/downloads/detail-iframe/?0[downloads][id]=847254104Imaging software
ParaformaldehydeUniversity MedstorePAR070.1For protein fixation  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Perfusion pumpVWR Internationalhttps://pr.vwr.com/store/product/4787969/vwr-variable-speed-peristaltic-pumpsNeeded for perfusion
ScalpelUniversity Medstore2580-M90-10For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
StereotaxicProvided by animal facilityN/ASo secure the animal for surgery
Surgical scissorUniversity Medstore22751-A9-240For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Surgical tapeUniversity Medstorehttps://www.amazon.ca/3M-Micropore-Tape-1530-2-Rolls/dp/B0082A9GS2Secure the animal on the diaper
SuturesUniversity Medstore2297-VS881For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
X2 tweezersUniversity Medstore7731-A10-612For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)

References

  1. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 69 (2020).
  2. Sethi, B., Kumar, V., Mahato, K., Coulter, D. W., Mahato, R. I.

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