Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Этот протокол представляет собой доступное руководство по сбору, хранению и размораживанию мононуклеарных клеток периферической крови, пригодное для последующих анализов и таких рабочих процессов, как проточная цитометрия и секвенирование РНК. Также демонстрируются коллекции плазмы и баффи-пальто.

Abstract

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) обычно используются в биомедицинских исследованиях иммунной системы и ее реакции на болезни и патогены. В этом подробном протоколе описывается оборудование, расходные материалы и этапы выделения, криоконсервирования и размораживания высококачественных и высокожизнеспособных PBMC из цельных клеток крови, пригодных для последующих применений, таких как проточная цитометрия и секвенирование РНК. Также описаны протоколы обработки плазмы и охристого покрова из цельной крови параллельно и одновременно с ПМЦ. Этот простой в использовании пошаговый протокол, в котором используется центрифугирование градиента плотности для выделения PBMC, сопровождается контрольным списком расходных материалов, оборудования и этапов подготовки. Этот протокол подходит для лиц с любым предыдущим опытом работы с лабораторными методами и может быть реализован в клинических или исследовательских лабораториях. Высококачественная жизнеспособность клеток и секвенирование РНК были получены в результате сбора PBMC операторами, не имевшими предварительного лабораторного опыта использования этого протокола.

Introduction

Этот протокол демонстрирует доступный метод и рабочий процесс для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ) из цельной крови. Этот протокол особенно предназначен для начинающих научных техников, студентов и сотрудников клинических лабораторий с целью облегчения сбора и криоконсервации PBMC без предварительного обучения лабораторным методам.

В этом протоколе используется центрифугирование для разделения компонентов цельной крови по плотности. Цельная кровь состоит из четырех основных компонентов, перечисленных в порядке убывания плотности: эритроциты/эритроциты (~45% об....

Protocol

Протокол исследования был одобрен Программой защиты человека UCSD и KUMC и соответствует Хельсинкской декларации. Все лица дали информированное согласие на участие и забор крови.

1. Переработка и криоконсервация МПМК

  1. За день до забора крови ?.......

Representative Results

После сбора и криоконсервации PBMC жизнеспособность размороженных PBMC, моноцитов и лимфоцитов из 56 уникальных образцов оценивали методом проточной цитометрии с использованием реагентов, перечисленных в таблице 4, в соответствии с инструкциями производителей .......

Discussion

Этот протокол сбора и криоконсервации PBMC был успешно реализован лицами, имеющими и не имеющими предварительного обучения в исследовательской лаборатории. В нашей заявке FACS и РНК-секвенирование высокожизнеспособных моноцитов, выделенных из хранящихся PBMC, привело к п.......

Disclosures

Авторы не имеют соответствующих финансовых или нефинансовых интересов, которые можно было бы раскрыть.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить пациентов, которые добровольно дали свое согласие, время и донорство образцов крови. Мы также выражаем признательность доктору Патрику Мориарти, Джули-Энн Даттон и Марку Макклеллену из Медицинского центра Канзасского университета за их сотрудничество и внедрение этого протокола в удаленном центре. CY получил исследовательскую поддержку в рамках гранта NIH 1K08HL150271.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1000 µL TipsGilsonF174501Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 mL tubeBiopioneeerCNT-15To hold Solutions 2/3
2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL CryovialsGlobe Scientific3012Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µL TipsGilsonF174201For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
50 mL Conical TubeCEM Corporation50-187-76832 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CD14 AntibodyBiolegend325621
CD16 AntibodyBiolegend360723
CD19 AntibodyBiolegend363007
CD3 AntibodyBiolegend300405
CD56 AntibodyBiolegend318303
CD66b AntibodyBiolegend305103
Cell StrainerBiopioneeerDGN2583671 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CPT Mononuclear Cell Preparation TubeBD Biosciences3627536 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer BoxSouthern LabwareSB2CC-81Holds 81 tubes
1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube RackFisherbrand05-669-45Holds up to 50 cryovials
DMSOInvitrogen15575020Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
DNase/RNase-Free Distilled WaterInvitrogen10977015Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
EDTA TubesBD Biosciences3666431 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DR AntibodyBiolegend307609
Human Serum AlbuminGeminiBio800-120Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcXBiolegend422301
IsopropanolSigma-AldrichW292912-1KG-KFor use in Mr. Frosty
Label PrinterPhomemoM110-WH
Live-Dead StainBiolegend423105
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001Holds up to 18 tubes.
2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense PipetteBrandtech705110
Multidispense Pipette TipsBrandtech705744Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 PipetteGilsonF144059M
P20 PipetteGilsonF144056MFor use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used.
Printer LabelsPhomemoPM-M110-3020Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free EDTA (0.5 M)InvitrogenAM9260GApproximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free PBS (10X)InvitrogenAM9625Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNasinPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVApproximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer PipettesFisherbrand13-711-7MApproximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tube HolderEndicott-Seymour14-781-15Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes

References

  1. Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. . Physiology, Blood Plasma. , (2018).
  2. Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activate....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE212

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved