Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Этот протокол представляет собой доступное руководство по сбору, хранению и размораживанию мононуклеарных клеток периферической крови, пригодное для последующих анализов и таких рабочих процессов, как проточная цитометрия и секвенирование РНК. Также демонстрируются коллекции плазмы и баффи-пальто.

Abstract

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) обычно используются в биомедицинских исследованиях иммунной системы и ее реакции на болезни и патогены. В этом подробном протоколе описывается оборудование, расходные материалы и этапы выделения, криоконсервирования и размораживания высококачественных и высокожизнеспособных PBMC из цельных клеток крови, пригодных для последующих применений, таких как проточная цитометрия и секвенирование РНК. Также описаны протоколы обработки плазмы и охристого покрова из цельной крови параллельно и одновременно с ПМЦ. Этот простой в использовании пошаговый протокол, в котором используется центрифугирование градиента плотности для выделения PBMC, сопровождается контрольным списком расходных материалов, оборудования и этапов подготовки. Этот протокол подходит для лиц с любым предыдущим опытом работы с лабораторными методами и может быть реализован в клинических или исследовательских лабораториях. Высококачественная жизнеспособность клеток и секвенирование РНК были получены в результате сбора PBMC операторами, не имевшими предварительного лабораторного опыта использования этого протокола.

Introduction

Этот протокол демонстрирует доступный метод и рабочий процесс для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ) из цельной крови. Этот протокол особенно предназначен для начинающих научных техников, студентов и сотрудников клинических лабораторий с целью облегчения сбора и криоконсервации PBMC без предварительного обучения лабораторным методам.

В этом протоколе используется центрифугирование для разделения компонентов цельной крови по плотности. Цельная кровь состоит из четырех основных компонентов, перечисленных в порядке убывания плотности: эритроциты/эритроциты (~45% об....

Protocol

Протокол исследования был одобрен Программой защиты человека UCSD и KUMC и соответствует Хельсинкской декларации. Все лица дали информированное согласие на участие и забор крови.

1. Переработка и криоконсервация МПМК

  1. За день до забора крови ?.......

Representative Results

После сбора и криоконсервации PBMC жизнеспособность размороженных PBMC, моноцитов и лимфоцитов из 56 уникальных образцов оценивали методом проточной цитометрии с использованием реагентов, перечисленных в таблице 4, в соответствии с инструкциями производителей .......

Discussion

Этот протокол сбора и криоконсервации PBMC был успешно реализован лицами, имеющими и не имеющими предварительного обучения в исследовательской лаборатории. В нашей заявке FACS и РНК-секвенирование высокожизнеспособных моноцитов, выделенных из хранящихся PBMC, привело к п.......

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить пациентов, которые добровольно дали свое согласие, время и донорство образцов крови. Мы также выражаем признательность доктору Патрику Мориарти, Джули-Энн Даттон и Марку Макклеллену из Медицинского центра Канзасского университета за их сотрудничество и внедрение этого протокола в удаленном центре. CY получил исследовательскую поддержку в рамках гранта NIH 1K08HL150271.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1000 µL TipsGilsonF174501Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 mL tubeBiopioneeerCNT-15To hold Solutions 2/3
2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL CryovialsGlobe Scientific3012Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µL TipsGilsonF174201For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
50 mL Conical TubeCEM Corporation50-187-76832 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CD14 AntibodyBiolegend325621
CD16 AntibodyBiolegend360723
CD19 AntibodyBiolegend363007
CD3 AntibodyBiolegend300405
CD56 AntibodyBiolegend318303
CD66b AntibodyBiolegend305103
Cell StrainerBiopioneeerDGN2583671 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CPT Mononuclear Cell Preparation TubeBD Biosciences3627536 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer BoxSouthern LabwareSB2CC-81Holds 81 tubes
1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube RackFisherbrand05-669-45Holds up to 50 cryovials
DMSOInvitrogen15575020Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
DNase/RNase-Free Distilled WaterInvitrogen10977015Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
EDTA TubesBD Biosciences3666431 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DR AntibodyBiolegend307609
Human Serum AlbuminGeminiBio800-120Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcXBiolegend422301
IsopropanolSigma-AldrichW292912-1KG-KFor use in Mr. Frosty
Label PrinterPhomemoM110-WH
Live-Dead StainBiolegend423105
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001Holds up to 18 tubes.
2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense PipetteBrandtech705110
Multidispense Pipette TipsBrandtech705744Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 PipetteGilsonF144059M
P20 PipetteGilsonF144056MFor use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used.
Printer LabelsPhomemoPM-M110-3020Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free EDTA (0.5 M)InvitrogenAM9260GApproximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free PBS (10X)InvitrogenAM9625Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNasinPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVApproximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer PipettesFisherbrand13-711-7MApproximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tube HolderEndicott-Seymour14-781-15Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes

References

  1. Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. . Physiology, Blood Plasma. , (2018).
  2. Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activate....

Explore More Articles

JoVE212

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved