A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Этот протокол представляет собой доступное руководство по сбору, хранению и размораживанию мононуклеарных клеток периферической крови, пригодное для последующих анализов и таких рабочих процессов, как проточная цитометрия и секвенирование РНК. Также демонстрируются коллекции плазмы и баффи-пальто.
Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) обычно используются в биомедицинских исследованиях иммунной системы и ее реакции на болезни и патогены. В этом подробном протоколе описывается оборудование, расходные материалы и этапы выделения, криоконсервирования и размораживания высококачественных и высокожизнеспособных PBMC из цельных клеток крови, пригодных для последующих применений, таких как проточная цитометрия и секвенирование РНК. Также описаны протоколы обработки плазмы и охристого покрова из цельной крови параллельно и одновременно с ПМЦ. Этот простой в использовании пошаговый протокол, в котором используется центрифугирование градиента плотности для выделения PBMC, сопровождается контрольным списком расходных материалов, оборудования и этапов подготовки. Этот протокол подходит для лиц с любым предыдущим опытом работы с лабораторными методами и может быть реализован в клинических или исследовательских лабораториях. Высококачественная жизнеспособность клеток и секвенирование РНК были получены в результате сбора PBMC операторами, не имевшими предварительного лабораторного опыта использования этого протокола.
Этот протокол демонстрирует доступный метод и рабочий процесс для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ) из цельной крови. Этот протокол особенно предназначен для начинающих научных техников, студентов и сотрудников клинических лабораторий с целью облегчения сбора и криоконсервации PBMC без предварительного обучения лабораторным методам.
В этом протоколе используется центрифугирование для разделения компонентов цельной крови по плотности. Цельная кровь состоит из четырех основных компонентов, перечисленных в порядке убывания плотности: эритроциты/эритроциты (~45% об....
Протокол исследования был одобрен Программой защиты человека UCSD и KUMC и соответствует Хельсинкской декларации. Все лица дали информированное согласие на участие и забор крови.
1. Переработка и криоконсервация МПМК
После сбора и криоконсервации PBMC жизнеспособность размороженных PBMC, моноцитов и лимфоцитов из 56 уникальных образцов оценивали методом проточной цитометрии с использованием реагентов, перечисленных в таблице 4, в соответствии с инструкциями производителей .......
Этот протокол сбора и криоконсервации PBMC был успешно реализован лицами, имеющими и не имеющими предварительного обучения в исследовательской лаборатории. В нашей заявке FACS и РНК-секвенирование высокожизнеспособных моноцитов, выделенных из хранящихся PBMC, привело к п.......
Мы хотели бы поблагодарить пациентов, которые добровольно дали свое согласие, время и донорство образцов крови. Мы также выражаем признательность доктору Патрику Мориарти, Джули-Энн Даттон и Марку Макклеллену из Медицинского центра Канзасского университета за их сотрудничество и внедрение этого протокола в удаленном центре. CY получил исследовательскую поддержку в рамках гранта NIH 1K08HL150271.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1000 µL Tips | Gilson | F174501 | Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
15 mL tube | Biopioneeer | CNT-15 | To hold Solutions 2/3 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
2 mL Cryovials | Globe Scientific | 3012 | Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
20 µL Tips | Gilson | F174201 | For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
50 mL Conical Tube | CEM Corporation | 50-187-7683 | 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
CD14 Antibody | Biolegend | 325621 | |
CD16 Antibody | Biolegend | 360723 | |
CD19 Antibody | Biolegend | 363007 | |
CD3 Antibody | Biolegend | 300405 | |
CD56 Antibody | Biolegend | 318303 | |
CD66b Antibody | Biolegend | 305103 | |
Cell Strainer | Biopioneeer | DGN258367 | 1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
CPT Mononuclear Cell Preparation Tube | BD Biosciences | 362753 | 6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
Cryo Freezer Box | Southern Labware | SB2CC-81 | Holds 81 tubes 1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
Cryotube Rack | Fisherbrand | 05-669-45 | Holds up to 50 cryovials |
DMSO | Invitrogen | 15575020 | Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10977015 | Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
EDTA Tubes | BD Biosciences | 366643 | 1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
Flavopiridol | Sigma-Aldrich | F3055-5MG | |
HLA-DR Antibody | Biolegend | 307609 | |
Human Serum Albumin | GeminiBio | 800-120 | Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
Human Trustain FcX | Biolegend | 422301 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292912-1KG-K | For use in Mr. Frosty |
Label Printer | Phomemo | M110-WH | |
Live-Dead Stain | Biolegend | 423105 | |
Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Holds up to 18 tubes. 2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
Multidispense Pipette | Brandtech | 705110 | |
Multidispense Pipette Tips | Brandtech | 705744 | Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
P1000 Pipette | Gilson | F144059M | |
P20 Pipette | Gilson | F144056M | For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. |
Printer Labels | Phomemo | PM-M110-3020 | Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted |
RNase-Free EDTA (0.5 M) | Invitrogen | AM9260G | Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
RNase-Free PBS (10X) | Invitrogen | AM9625 | Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted |
RNasin | Promega | N2111 | |
RPMI | Corning | 10-040-CV | Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection |
Tube Holder | Endicott-Seymour | 14-781-15 | Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved