Выделение и криоконсервация высокожизнеспособных мононуклеарных клеток периферической крови человека из цельной крови: руководство для начинающих

Summary

Этот протокол представляет собой доступное руководство по сбору, хранению и размораживанию мононуклеарных клеток периферической крови, пригодное для последующих анализов и таких рабочих процессов, как проточная цитометрия и секвенирование РНК. Также демонстрируются коллекции плазмы и баффи-пальто.

Abstract

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) обычно используются в биомедицинских исследованиях иммунной системы и ее реакции на болезни и патогены. В этом подробном протоколе описывается оборудование, расходные материалы и этапы выделения, криоконсервирования и размораживания высококачественных и высокожизнеспособных PBMC из цельных клеток крови, пригодных для последующих применений, таких как проточная цитометрия и секвенирование РНК. Также описаны протоколы обработки плазмы и охристого покрова из цельной крови параллельно и одновременно с ПМЦ. Этот простой в использовании пошаговый протокол, в котором используется центрифугирование градиента плотности для выделения PBMC, сопровождается контрольным списком расходных материалов, оборудования и этапов подготовки. Этот протокол подходит для лиц с любым предыдущим опытом работы с лабораторными методами и может быть реализован в клинических или исследовательских лабораториях. Высококачественная жизнеспособность клеток и секвенирование РНК были получены в результате сбора PBMC операторами, не имевшими предварительного лабораторного опыта использования этого протокола.

Introduction

Этот протокол демонстрирует доступный метод и рабочий процесс для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ) из цельной крови. Этот протокол особенно предназначен для начинающих научных техников, студентов и сотрудников клинических лабораторий с целью облегчения сбора и криоконсервации PBMC без предварительного обучения лабораторным методам.

В этом протоколе используется центрифугирование для разделения компонентов цельной крови по плотности. Цельная кровь состоит из четырех основных компонентов, перечисленных в порядке убывания плотности: эритроциты/эритроциты (~45% об....

Protocol

Протокол исследования был одобрен Программой защиты человека UCSD и KUMC и соответствует Хельсинкской декларации. Все лица дали информированное согласие на участие и забор крови.

1. Переработка и криоконсервация МПМК

1. За день до забора крови ?.......

Discussion

Этот протокол сбора и криоконсервации PBMC был успешно реализован лицами, имеющими и не имеющими предварительного обучения в исследовательской лаборатории. В нашей заявке FACS и РНК-секвенирование высокожизнеспособных моноцитов, выделенных из хранящихся PBMC, привело к п.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Tips	Gilson	F174501	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 mL tube	Biopioneeer	CNT-15	To hold Solutions 2/3 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL Cryovials	Globe Scientific	3012	Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µL Tips	Gilson	F174201	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
50 mL Conical Tube	CEM Corporation	50-187-7683	2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CD14 Antibody	Biolegend	325621
CD16 Antibody	Biolegend	360723
CD19 Antibody	Biolegend	363007
CD3 Antibody	Biolegend	300405
CD56 Antibody	Biolegend	318303
CD66b Antibody	Biolegend	305103
Cell Strainer	Biopioneeer	DGN258367	1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CPT Mononuclear Cell Preparation Tube	BD Biosciences	362753	6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer Box	Southern Labware	SB2CC-81	Holds 81 tubes 1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube Rack	Fisherbrand	05-669-45	Holds up to 50 cryovials
DMSO	Invitrogen	15575020	Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977015	Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
EDTA Tubes	BD Biosciences	366643	1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Flavopiridol	Sigma-Aldrich	F3055-5MG
HLA-DR Antibody	Biolegend	307609
Human Serum Albumin	GeminiBio	800-120	Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcX	Biolegend	422301
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292912-1KG-K	For use in Mr. Frosty
Label Printer	Phomemo	M110-WH
Live-Dead Stain	Biolegend	423105
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Holds up to 18 tubes. 2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense Pipette	Brandtech	705110
Multidispense Pipette Tips	Brandtech	705744	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 Pipette	Gilson	F144059M
P20 Pipette	Gilson	F144056M	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used.
Printer Labels	Phomemo	PM-M110-3020	Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free EDTA (0.5 M)	Invitrogen	AM9260G	Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free PBS (10X)	Invitrogen	AM9625	Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNasin	Promega	N2111
RPMI	Corning	10-040-CV	Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-7M	Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tube Holder	Endicott-Seymour	14-781-15	Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes