使用 κ-角叉菜胶亚微凝胶培养基对组织样结构进行嵌入式生物打印

Summary

本研究介绍了一种新型 κ-角叉菜胶亚微凝胶悬浮浴，显示出显着的可逆干扰-非干扰过渡特性。这些属性有助于在嵌入式 3D 生物打印中构建仿生组织和器官。成功打印具有高分辨率和细胞生长的心脏/食管样组织，展示了高质量的生物打印和组织工程应用。

Abstract

利用颗粒水凝胶支撑浴的嵌入式三维 （3D） 生物打印已成为创建仿生支架的关键技术。然而，设计一种合适的凝胶悬浮培养基来平衡精确的生物墨水沉积与细胞活力和功能存在多重挑战，尤其是在实现所需的粘弹性方面。在这里，通过易于操作的机械研磨工艺制造了一种新型 κ-角叉菜胶凝胶支撑浴，产生均匀的亚微米级颗粒。这些亚微凝胶表现出典型的 Bingham 流动行为，具有较小的屈服应力和快速剪切稀化特性，有助于生物墨水的顺利沉积。此外， κ-卡拉胶微凝胶网络的可逆凝胶-溶胶转变和自愈能力确保了打印结构的结构完整性，从而能够创建具有明确结构特征的复杂、多层组织结构。打印后， κ-角叉菜胶亚微凝胶可以通过简单的磷酸盐缓冲盐水洗涤轻松去除。使用载细胞生物墨水的进一步生物打印表明，仿生构建体内的细胞具有 92% 的高活力，可快速扩展伪足，并保持稳健的增殖，表明这种生物打印策略在组织和器官制造方面的潜力。总之，这种新型 κ-角叉菜胶亚微凝胶培养基成为一种有前途的高质量嵌入式生物打印途径，对工程组织和器官的 体外 发育具有深远的影响。

Introduction

组织工程支架，包括静电纺丝纤维、多孔海绵和聚合物水凝胶，通过提供支持细胞生长、组织再生和器官功能恢复的结构框架，在受损组织和器官的修复和重建中发挥关键作用 ^1,2,3.然而，传统支架在准确复制天然组织结构方面遇到了挑战，导致工程组织和天然组织不匹配。这种限制阻碍了缺陷组织的有效愈合，强调了支架设计进步以实现更准确的仿生学的迫切需求。三维 （3D） 生物打印是一种创新的制造技术，它使用生物材料墨水和细胞逐层精确构建复杂的生物组织结构⁴。在各种生物材料中，聚合物水凝胶成为理想的生物墨水，其独特的网络有助于细胞的原位封装，并关键地支持其生长 ^5,6。然而，当用作生物墨水时，许多柔软且高度水合的水凝胶在打印过程中往往会诱导打印的支架结构模糊或快速塌陷。为了应对这一挑战，嵌入式 3D 生物打印技术采用微凝胶浴作为支撑材料，可实现精确的软生物墨水沉积。水凝胶生物墨水凝胶化后，通过去除微凝胶浴获得具有复杂结构的精制仿生支架。明胶 ^7,8、琼脂糖

Protocol

1. κ -角叉菜胶亚微凝胶混悬浴的制备

1. 通过将 1.75 g κ-卡拉胶粉末添加到 1,000 mL 玻璃瓶中的 500 mL 磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）溶液中，制备 500 mL κ-卡拉胶悬浮浴（0.35% wt/vol）。
2. 将 70 mm 磁力搅拌棒引入玻璃瓶中以搅拌水性混合物。拧紧玻璃瓶盖，然后松开半圈。
3. 将玻璃瓶置于 70 °C 水浴中并加热。以 300 rpm 的速度打开磁力搅拌器，放置瓶子.......

Discussion

用于生物打印的 κ-角叉菜胶亚微凝胶悬浮浴的制备是一个精心策划的过程，涉及几个关键步骤，以确保所得培养基表现出支持生物墨水所需的特性。最初，通过将 κ-卡拉胶粉末在高温下溶解在去离子水中，形成均匀的混合物来制备 κ-卡拉胶溶液。溶液的浓度是关键，必须针对后续的凝胶化进行优化。0.3-0.6% （wt/vol） κ-

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D bioprinter	Custom-designed
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole	Solarbio Life Science	C0065	Ready-to-use
405 nm UV light	EFL	XY-WJ01
Cell Counter	Corning	Cyto smart 6749
Confocal laser scanning microscope	Leica	STELLARIS 5
DMEM high glucose	VivaCell	C3113-0500	High Glucose, with Sodium Pyruvate and L-Glutamine
Dynamic rotational rheometer	TA Instrument	Discovery HR-20
Esophageal smooth muscle cells	Supplied by the Department of Cell Biology and Regenerative Medicine, Health Science Center, Ningbo University		Primary cells from the rabbit esophagus
Fetal bovine serum	UE	F9070L
Fluorescein isothiocyanate labeled phalloidin	Solarbio Life Science	CA1610	300T
Gelatin methacrylate	EFL	EFL-GM-60	60% substitution
k-carrageenan	Aladdin	C121013-100g	Reagent grade
Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphinate	Aladdin	L157759-1g	365~405 nm
Live-Dead kit	beyotime	C2015M
Microplate reader	Potenov	PT-3502B
Paraformaldehyde	Solarbio Life Science	P1110	4%
Penicillin/streptomycin	Solarbio Life Science	MA0110	100 ´
Phosphate buffered saline	VivaCell	C3580-0500	pH 7.2-7.4
Silk fibroin methacrylate	EFL	EFL-SilMA-001	39% substitution
Triton X-100	Solarbio Life Science	T8200
Trypsin-EDTA	VivaCell	C100C1	0.25%, without phenol red