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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

本研究描述了一种建立人单核细胞衍生的小胶质细胞样 (iMG) 细胞的新方法,该方法能够间接评估脑炎症。这提出了一种细胞模型,可能有利于专注于大脑潜在炎症和相关神经精神疾病的研究。

Abstract

最近采用动物模型的研究强调了小胶质细胞作为各种神经精神和物理疾病中关键免疫调节剂的重要性。死后脑分析和正电子发射断层扫描成像是评估人类患者小胶质细胞活化的代表性研究方法;研究结果揭示了患有各种神经精神疾病和慢性疼痛的患者大脑中小胶质细胞的激活。尽管如此,上述技术仅有助于评估小胶质细胞激活的有限方面。

代替脑活检和诱导多能干细胞技术,我们最初设计了一种技术,通过补充粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素 34 来从新鲜衍生的人外周血单核细胞中直接产生诱导的小胶质细胞样 (iMG) 细胞 2 周。这些 iMG 细胞可用于对细胞水平应激刺激后的吞噬能力和细胞因子释放进行动态形态学和分子水平分析。最近,全面的转录组分析已被用于验证人类 iMG 细胞和大脑原代小胶质细胞之间的相似性。

患者来源的 iMG 细胞可作为预测人脑中小胶质细胞活化的关键替代标志物,并有助于揭示 Nasu-Hakola 病、纤维肌痛、双相情感障碍和烟雾病患者以前未知的小胶质细胞动态病理生理学。因此,基于 iMG 的技术是一种有价值的逆向翻译工具,并为阐明各种精神和身体疾病中小胶质细胞的分子病理生理学提供了新的见解。

Introduction

近年来,脑炎症被认为在各种脑和神经精神疾病的病理生理学中起着关键作用;通过人类死后脑分析和基于正电子发射断层扫描 (PET) 的生物成像技术,小胶质细胞被强调为关键的免疫调节细胞 1,2,3,4。死后脑部和 PET 成像分析揭示了重要的发现;然而,这些方法在完整捕获大脑中人类小胶质细胞的动态分子活动方面效率低下。因此,需要新的策略来能够在分子和细胞水平上全面评估人类小胶质细胞功能和功能障碍。

2014 年,我们最初设计了一种新技术来生产直接诱导的小胶质细胞样 (iMG) 细胞 5,6,然后在 2016 年首次发表人诱导多能干细胞 (iPSC) 衍生的小胶质细胞样细胞7。在短短 2 周内,我们通过优化细胞因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 和白细胞介素 34 (IL-34) 成功地将人外周血单核细胞转化为 iMG 细胞。当我们开发这项技术时,从 iPS 细胞或成纤维细胞诱导神经元细胞的创新重编程方法才刚刚开始在世界上流行

Protocol

该研究方案得到了九州大学伦理委员会的批准,并遵守了赫尔辛基宣言的所有规定。获得所有参与者(包括健康志愿者和患者)的书面知情同意书,以分析他们的血液并发布他们的数据。材料和设备在 材料表中列出,解决方案的组成在 表 1 中详细说明。

1. 制备实验用培养基和缓冲液

  1. 通过用 10% 热灭活的胎牛血清(56°C,30 分钟).......

Representative Results

重要的是,iMG 细胞的特征(包括形态和基因表达)存在大量的人级和时间级异质性。某些个体的 iMG 细胞呈现出许多分支外观(图 1A),而在其他个体中,它们保持球形(图 1B)。iMG 特征甚至在单个个体内也可能不同,这使得 iMG 细胞成为检测疾病状态生物标志物的关键工具。相反,对这种个体间差异的检查保证了技术错误的减少。iMG 细胞定义为用 GM.......

Discussion

采用 iMG 细胞的分析技术可作为有效的逆向转化研究工具 5,6。为了产生足够数量的人类 iMG 细胞,实验者在设计研究时应考虑某些问题。来自人类的血液样本非常敏感;因此,获得的样品需要及时处理和细致处理,以避免污染。具体来说,抽取血样后应立即分离,不要长时间无人看管。实验通常在采血后 3 小时内开始以确认其有效性;但是,可以将血液样?.......

Disclosures

作者没有什么可披露的。

Acknowledgements

这项工作得到了以下科学研究资助金的部分支持:(1) 日本科学振兴会 (KAKENHI;JP18H04042、JP19K21591、JP20H01773 和 JP22H00494 到 TAK,JP22H03000 到 M.O.);(2) 日本医疗研究与开发机构 (AMED;JP21wm0425010 至 TAK,JP22dk0207065 至 M.O.)(3) 日本科学技术振兴机构 CREST(JPMJCR22N5 TAK)。资助机构在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面不承担任何责任。感谢 Editage (www.editage.jp) 的英文编辑工作。

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1% Triton X-100Sigma-Aldrich30-5140-5
4% paraformaldehydeNacalai Tesque09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)gibco15240-062described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec130-091-222described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeadsMiltenyi Biotec130–049-601
DAPI solutionDOJINDO28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineNacalai Tesque14249-24described as "PBS (−)"
Fetal Bovine SerumbiowestS1760-500
Histopaque-1077Sigma-Aldrich10771described as "density gradient medium"
Human FcR Blocking ReagentMiltenyi Biotec130–059-901
LeucosepGreiner Bio-One227290described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columnsMiltenyi Biotec130-042-401described as "magnetic column"
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303described as "magnetic stand"
Penicillin-StreptomycinNacalai Tesque26253–84
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP10144described as "mounting media"
recombinant human GM-CSFR&D Systems215-GM
recombinant human IL-34R&D Systems5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)Thermo Fisher Scientific61870036described as "basal induction medium"
RPMI-1640Nacalai Tesque30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibodySigma-AldrichHPA014518primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibodySigma-AldrichHPA051870primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568invitrogenA-11011secondary antibody, rabbit, 1:1000

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