הנדסה של תאים דמויי מיקרוגליה המושרים על ידי דם אנושי לחקר המוח בתרגום לאחור

Summary

מחקר זה מתווה גישה חדשנית להקמת תאים דמויי מיקרוגליה (iMG) שמקורם במונוציטים אנושיים המאפשרים הערכה עקיפה של דלקת במוח. זה מציג מודל תאי שעשוי להועיל למחקר המתמקד בדלקת פוטנציאלית במוח ובהפרעות נוירופסיכיאטריות נלוות.

Abstract

מחקרים אחרונים שהשתמשו במודלים של בעלי חיים הדגישו את חשיבותם של תאי מיקרוגליה כמודולטורים אימונולוגיים חיוניים במחלות נוירופסיכיאטריות ופיזיות שונות. ניתוח מוח לאחר המוות והדמיית טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים הן שיטות מחקר מייצגות המעריכות הפעלת מיקרוגליאה בחולים אנושיים; הממצאים חשפו את הפעלת תאי המיקרוגליה במוחם של חולים המציגים הפרעות נוירופסיכיאטריות שונות וכאב כרוני. עם זאת, הטכניקה הנ"ל רק מקלה על הערכה של היבטים מוגבלים של הפעלת מיקרוגליה.

במקום ביופסיית מוח וטכניקת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, פיתחנו בתחילה טכניקה ליצירת תאים דמויי מיקרוגליה המושרים ישירות (iMG) ממונוציטים אנושיים טריים בדם היקפי על ידי השלמתם עם גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים ואינטרלוקין 34 למשך שבועיים. תאי iMG אלה יכולים לשמש לביצוע ניתוחים מורפולוגיים ומולקולריים דינמיים בנוגע לקיבולת פגוציטית ושחרור ציטוקינים לאחר גירוי מתח ברמת התא. לאחרונה, ניתוח שעתוק מקיף שימש כדי לאמת את הדמיון בין תאי iMG אנושיים לבין מיקרוגליה ראשונית במוח.

תאי iMG שמקורם במטופל עשויים לשמש כסמנים חלופיים מרכזיים לחיזוי הפעלת מיקרוגליאה במוחות אנושיים וסייעו בחשיפת פתופיזיולוגיה דינמית שלא הייתה ידועה בעבר של מיקרוגליה בחולים עם מחלת Nasu-Hakola, פיברומיאלגיה, הפרעה דו קוטבית ומחלת Moyamoya. לכן, הטכניקה מבוססת iMG משמשת ככלי רב ערך לתרגום לאחור ומספקת תובנות חדשניות להבהרת הפתופיזיולוגיה המולקולרית של תאי מיקרוגליה במגוון מחלות נפשיות ופיזיות.

Introduction

בשנים האחרונות הוצע כי דלקת במוח תופסת תפקידים מרכזיים בפתופיזיולוגיה של הפרעות מוח ונוירופסיכיאטריות שונות; תאי המיקרוגליה הודגשו כתאים אימונומודולטוריים מרכזיים על ידי ניתוח מוח אנושי לאחר המוות וטומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) המבוססות על טכניקות הדמיה ביולוגית 1,2,3,4. ניתוחי הדמיה של המוח וה-PET לאחר המוות מגלים ממצאים משמעותיים; עם זאת, גישות אלה אינן יעילות במונחים של לכידת הפעילות המולקולרית הדינמית של תאי מיקרוגליה אנושיים במוח בשלמותם. לכן, נדרשות אסטרטגיות חדשניות כדי לאפשר הערכה מקיפה של תפקודי מיקרוגליאה אנושיים ותפקוד לקוי ....

Protocol

פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת קיושו ועמד בכל הוראות הצהרת הלסינקי. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המשתתפים, כולל מתנדבים בריאים וחולים, לנתח את דמם ולפרסם את נתונם. החומרים והציוד מפורטים בטבלת החומרים, והרכבי הפתרונות מפורטים בטבלה 1.

Discussion

טכניקות אנליטיות המשתמשות בתאי iMG עשויות לשמש ככלי מחקר רבי עוצמה לתרגום לאחור ^5,6. כדי לייצר כמויות מספיקות של תאי iMG אנושיים, הנסיינים צריכים לתכנן את מחקריהם תוך התחשבות בנושאים מסוימים. דגימות דם שמקורן בבני אדם הן רגישות ביותר; כתוצאה מכך, הדגימות המתקבל?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% paraformaldehyde	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI solution	DOJINDO	28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Nacalai Tesque	14249-24	described as "PBS (−)"
Fetal Bovine Serum	biowest	S1760-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	described as "density gradient medium"
Human FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	described as "magnetic column"
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	described as "magnetic stand"
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144	described as "mounting media"
recombinant human GM-CSF	R&D Systems	215-GM
recombinant human IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	secondary antibody, rabbit, 1:1000