Engenharia de células semelhantes à microglia induzidas por sangue humano para pesquisa cerebral de tradução reversa

Summary

Este estudo delineia uma nova abordagem para o estabelecimento de células semelhantes à micróglia derivadas de monócitos humanos (iMG) que permitem a avaliação indireta da inflamação cerebral. Isso apresenta um modelo celular que pode ser benéfico para pesquisas com foco na inflamação potencial do cérebro e distúrbios neuropsiquiátricos associados.

Abstract

Investigações recentes empregando modelos animais destacaram a importância da microglia como moduladores imunológicos cruciais em várias doenças neuropsiquiátricas e físicas. A análise cerebral post-mortem e a tomografia por emissão de pósitrons são métodos de pesquisa representativos que avaliam a ativação microglial em pacientes humanos; Os resultados revelaram a ativação da microglia no cérebro de pacientes que apresentam vários distúrbios neuropsiquiátricos e dor crônica. No entanto, a técnica acima mencionada apenas facilita a avaliação de aspectos limitados da ativação microglial.

Em vez da biópsia cerebral e da técnica de células-tronco pluripotentes induzidas, inicialmente desenvolvemos uma técnica para gerar células semelhantes à microglia diretamente induzidas (iMG) a partir de monócitos do sangue periférico humano recém-derivados, suplementando-os com fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos e interleucina 34 por 2 semanas. Essas células iMG podem ser empregadas para realizar análises dinâmicas morfológicas e moleculares em relação à capacidade fagocítica e liberações de citocinas após estimulação de estresse em nível celular. Recentemente, a análise abrangente do transcriptoma foi usada para verificar a semelhança entre as células iMG humanas e a micróglia primária do cérebro.

As células iMG derivadas do paciente podem servir como marcadores substitutos importantes para prever a ativação microglial em cérebros humanos e ajudaram na revelação da fisiopatologia dinâmica anteriormente desconhecida da microglia em pacientes com doença de Nasu-Hakola, fibromialgia, transtorno bipolar e doença de Moyamoya. Portanto, a técnica baseada em iMG serve como uma valiosa ferramenta de tradução reversa e fornece novos insights para elucidar a fisiopatologia molecular da microglia em uma variedade de doenças mentais e físicas.

Introduction

Nos últimos anos, foi sugerido que a inflamação cerebral assume papéis fundamentais na fisiopatologia de vários distúrbios cerebrais e neuropsiquiátricos; as microglias foram destacadas como células-chave imunomoduladoras por análise cerebral post-mortem humana e técnicas de bioimagem baseadas em tomografia por emissão de pósitrons (PET) 1,2,3,4. As análises cerebrais post-mortem e de imagem PET revelam achados significativos; No entanto, no entanto, essas abordagens são ineficientes em termos de capturar as atividades moleculares dinâmicas ....

Protocol

O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Kyushu e cumpriu todas as disposições da Declaração de Helsinque. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes, incluindo voluntários saudáveis e pacientes, para analisar seu sangue e publicar seus dados. Os materiais e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais e as composições das soluções são detalhadas na Tabela 1.

1. Prepara.......

Discussion

Técnicas analíticas que empregam células iMG podem servir como potentes ferramentas de pesquisa de tradução reversa ^5,6. Para gerar quantidades suficientes de células iMG humanas, os experimentadores devem projetar seus estudos levando em consideração certas questões. Amostras de sangue derivadas de seres humanos são extremamente sensíveis; consequentemente, as amostras obtidas garantem um processamento imediato e um manuseio meticuloso para evitar con.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% paraformaldehyde	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI solution	DOJINDO	28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Nacalai Tesque	14249-24	described as "PBS (−)"
Fetal Bovine Serum	biowest	S1760-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	described as "density gradient medium"
Human FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	described as "magnetic column"
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	described as "magnetic stand"
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144	described as "mounting media"
recombinant human GM-CSF	R&D Systems	215-GM
recombinant human IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	secondary antibody, rabbit, 1:1000