Инженерия индуцированных кровью микроглииподобных клеток человека для исследования обратно-трансляционного мозга

Summary

В этом исследовании представлен новый подход к созданию микроглииподобных (iMG) клеток человека, полученных из моноцитов, которые позволяют косвенно оценить воспаление мозга. Это представляет собой клеточную модель, которая может быть полезна для исследований, сосредоточенных на потенциальном воспалении мозга и связанных с ним нервно-психических расстройствах.

Abstract

Недавние исследования с использованием животных моделей подчеркнули важность микроглии как важнейших иммунологических модуляторов при различных нейропсихиатрических и физических заболеваниях. Посмертный анализ мозга и позитронно-эмиссионная томография являются репрезентативными методами исследования, которые оценивают активацию микроглии у пациентов; Полученные данные выявили активацию микроглии в головном мозге пациентов с различными нервно-психическими расстройствами и хронической болью. Тем не менее, вышеупомянутая методика лишь облегчает оценку ограниченных аспектов активации микроглии.

Вместо биопсии головного мозга и метода индуцированных плюрипотентных стволовых клеток мы первоначально разработали метод получения непосредственно индуцированных микроглиоподобных (iMG) клеток из свежеполученных моноцитов периферической крови человека путем добавления к ним гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и интерлейкина 34 в течение 2 недель. Эти iMG-клетки могут быть использованы для выполнения динамического морфологического и молекулярного анализа фагоцитарной способности и высвобождения цитокинов после стрессовой стимуляции на клеточном уровне. В последнее время для проверки сходства между человеческими iMG-клетками и первичной микроглией мозга был проведен комплексный транскриптомный анализ.

Полученные от пациента iMG-клетки могут служить ключевыми суррогатными маркерами для прогнозирования активации микроглии в мозге человека и помогли раскрыть ранее неизвестную динамическую патофизиологию микроглии у пациентов с болезнью Насу-Хакола, фибромиалгией, биполярным расстройством и болезнью Мойя-Мойя. Таким образом, метод, основанный на iMG, служит ценным инструментом обратной трансляции и обеспечивает новое понимание динамики молекулярной патофизиологии микроглии при различных психических и физических заболеваниях.

Introduction

В последние годы было высказано предположение, что воспаление головного мозга играет ключевую роль в патофизиологии различных расстройств мозга и нервно-психических расстройств; микроглия была выделена в качестве ключевых иммуномодулирующих клеток с помощью посмертного анализа мозга человека и методов биовизуализации на основе позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) 1,2,3,4. Посмертный анализ мозга и ПЭТ позволяет получить важные результаты; Тем не менее, эти подходы неэффективны с точки зрения захвата динамической молекулярной активности ми....

Protocol

Протокол исследования был одобрен Этическим комитетом Университета Кюсю и соответствовал всем положениям Хельсинкской декларации. Было получено письменное информированное согласие от всех участников, включая здоровых добровольцев и пациентов, на анализ их крови и публикацию данных.......

Discussion

Аналитические методы с использованием iMG-клеток могут служить мощными инструментами обратнотрансляционных исследований ^5,6. Чтобы получить достаточное количество человеческих iMG-клеток, экспериментаторы должны планировать свои исследования с учетом о?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% paraformaldehyde	Nacalai Tesque	09154-14
Antibiotic-Antimycotic (100x)	gibco	15240-062	described as "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	described as "basic buffer solution" and used for "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI solution	DOJINDO	28718-90-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Nacalai Tesque	14249-24	described as "PBS (−)"
Fetal Bovine Serum	biowest	S1760-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	described as "density gradient medium"
Human FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	described as "density gradient centrifugation tube"
MACS LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	described as "magnetic column"
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	described as "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	described as "magnetic stand"
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144	described as "mounting media"
recombinant human GM-CSF	R&D Systems	215-GM
recombinant human IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)	Thermo Fisher Scientific	61870036	described as "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	primary antibody, rabbit, 1:100
anti-TMEM119 antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	primary antibody, rabbit, 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	secondary antibody, rabbit, 1:1000