אנו מביעים את הערכתנו הרבה לג'יה-יי סון וללו יאנג במכון החדשני לרפואה סינית ורוקחות, אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית, על הסיוע בציטומטריית זרימה, קויפינג צ'ן במעבדת המפתח הממלכתית של משאבי הרפואה הסינית הדרום-מערבית, על העזרה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין [82104491], הקרן למדעי הטבע של סצ'ואן [2023NSFSC0674], והקרן למדע פוסט-דוקטורט של סין [2021M693789].

1. קו תאים ותרבית תאים
<ol><li>לגדל את קו התאים המונוציטיים האנושיים THP-1 בתווך תרבית שלם RPMI-1640 עם 10% נסיוב בקר עוברי, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-0.05 מילימטר β-מרקפטואתנול. תרבית את התאים ב 37 ° C ב 5% CO2 אוויר לח. תאי תרבית כל 2-3 ימים. הערה: THP-1 הוא תא תרחיף, בחר לשנות מחצית מהמדיום עבור תת...

ניתוח מנגנוני מוות של תאים המופעלים על ידי LPS/ATP בתאי THP-1

<ol>
	<li>Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis,+pyroptosis+and+apoptosis:+an+intricate+game+of+cell+death.">Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death.</a> Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).</li><li>Rao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptosis+in+inflammatory+diseases+and+cancer.">Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer.</a> Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).</li><li>Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptosis+and+the+cellular+consequences+of+gasdermin+pores.">Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores.</a> Semin Immunol. 69, 101803 (2023).</li><li>Kovacs, S. B., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gasdermins:+Effectors+of+pyroptosis.">Gasdermins: Effectors of pyroptosis.</a> Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).</li><li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NINJ1+mediates+plasma+membrane+rupture+during+lytic+cell+death.">NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death.</a> Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).</li><li>Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+pyroptosis,+and+necroptosis-Oh+my!+The+many+ways+a+cell+can+die.">Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die.</a> J Mol Biol. 434 (4), 167378 (2022).</li><li>Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell-derived+exosomes:+messages+from+dying+cells.">Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells.</a> Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).</li><li>Imre, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+signalling+in+virus+infection.">Cell death signalling in virus infection.</a> Cell Signal. 76, 109772 (2020).</li><li>Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL:+Functions+beyond+serving+as+the+Executioner+of+Necroptosis.">MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis.</a> Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).</li><li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+macrophages+deal+with+death.">How macrophages deal with death.</a> Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endotoxin+activates+the+coagulation+cascade+through+gasdermin+D-dependent+phosphatidylserine+exposure.">Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure.</a> Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).</li><li>Gong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESCRT-III+acts+downstream+of+MLKL+to+regulate+necroptotic+cell+death+and+its+consequences.">ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences.</a> Cell. 169 (2), 286-300 (2017).</li><li>Dong, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cell+surface+expression+of+phosphatidylserine+in+ovarian+carcinoma+effusions+using+the+annexin-V/7-AAD+assay:+clinical+relevance+and+comparison+with+other+apoptosis+parameters.">Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters.</a> Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).</li><li>JoVE, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM),+JoVE+Science+Education+Database,+Analytical+Chemistry.">Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry.</a> JoVE. , (2024).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptosis+is+driven+by+non-selective+gasdermin-D+pore+and+its+morphology+is+different+from+MLKL+channel-mediated+necroptosis.">Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis.</a> Cell Res. 26 (9), 1007-1020 (2016).</li><li>Herr, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+characteristics+of+DHA-induced+pyroptosis.">Ultrastructural characteristics of DHA-induced pyroptosis.</a> Neuromol Med. 22 (2), 293-303 (2020).</li><li>Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide/adenosine+triphosphate+induces+IL-1&#946;+and+IL-18+secretion+through+the+NLRP3+inflammasome+in+RAW264.7+murine+macrophage+cells.">Lipopolysaccharide/adenosine triphosphate induces IL-1&#946; and IL-18 secretion through the NLRP3 inflammasome in RAW264.7 murine macrophage cells.</a> Int Mol Med. 34 (1), 341-349 (2014).</li><li>Gurung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FADD+and+caspase-8+mediate+priming+and+activation+of+the+canonical+and+noncanonical+Nlrp3+inflammasomes.">FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes.</a> J Immunol. 192 (4), 1835-1846 (2014).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+caspase-1+protects+against+TBI-induced+pyroptosis+in+vitro+and+in+vivo.">Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo.</a> J Neuroinflam. 15 (1), 48 (2018).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3&#946;-mediated+activation+of+NLRP3+inflammasome+leads+to+pyroptosis+and+apoptosis+of+rat+cardiomyocytes+and+fibroblasts.">GSK-3&#946;-mediated activation of NLRP3 inflammasome leads to pyroptosis and apoptosis of rat cardiomyocytes and fibroblasts.</a> Euro J Pharmacol. 920, 174830 (2022).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP3+dependent+NLRP3+inflammasome+activation+is+implicated+in+acute+lung+injury+in+mice.">RIP3 dependent NLRP3 inflammasome activation is implicated in acute lung injury in mice.</a> J Transl Med. 16 (1), 233 (2018).</li><li>Rogers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gasdermin+pores+permeabilize+mitochondria+to+augment+caspase-3+activation+during+apoptosis+and+inflammasome+activation.">Gasdermin pores permeabilize mitochondria to augment caspase-3 activation during apoptosis and inflammasome activation.</a> Nat Comm. 10 (1), 1689 (2019).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+drugs+induce+pyroptosis+through+caspase-3+cleavage+of+a+gasdermin.">Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin.</a> Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).</li><li>Kang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-8+scaffolding+function+and+MLKL+regulate+NLRP3+inflammasome+activation+downstream+of+TLR3.">Caspase-8 scaffolding function and MLKL regulate NLRP3 inflammasome activation downstream of TLR3.</a> Nat Comm. 6, 7515 (2015).</li><li>Wang, Y., Kanneganti, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+pyroptosis,+apoptosis+and+necroptosis+to+PANoptosis:+A+mechanistic+compendium+of+programmed+cell+death+pathways.">From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways.</a> Comput Str Biotechnol J. 19, 4641-4657 (2021).</li><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodiola+crenulata+alleviates+hypobaric+hypoxia-induced+brain+injury+by+maintaining+BBB+integrity+and+balancing+energy+metabolism+dysfunction.">Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction.</a> Phytomedicine. 128, 155529 (2024).</li><li>Shuwen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+induction+in+CD8++T+cell+exhaustion+in+colorectal+cancer+via+the+regulation+of+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites.">Cholesterol induction in CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer via the regulation of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites.</a> Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4441-4456 (2023).</li><li>Luo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+induced+intestinal+injury+is+alleviated+by+blocking+the+TLR9/caspase3/GSDME+mediated+intestinal+epithelium+pyroptosis.">Cyclophosphamide induced intestinal injury is alleviated by blocking the TLR9/caspase3/GSDME mediated intestinal epithelium pyroptosis.</a> Int Immunopharmacol. 119, 110244 (2023).</li></ol>

בכתב יד זה, שתי שיטות שימשו לזיהוי LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA. נעשה שימוש בצביעה כפולה של Annexin V/7-AAD, והתוצאות נותחו על ידי ציטומטריית זרימה מהצביעה הכוללת. כמו באנליזה ציטומטרית זרימה אחרת, קבוצה של תאים לא מוכתמים ושתי קבוצות של תאים מוכתמים בודדים הוקמו כדי לא לכלול תו...

מוות תאי הוא תהליך פיזיולוגי בסיסי בכל האורגניזמים החיים. בשנים האחרונות, מחקרים משמעותיים הראו כי מוות תאי מעורב בחסינות ובאיזון בתוך האורגניזם. חקר מוות תאי עוזר לנו להבין טוב יותר את הופעתן והתפתחותן של מחלות. תוארו מספר צורות של מוות תאי מתוכנת, וכמה מטרות מפתח בתהליכים אלה זוהו. פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס הם שלושת מסלולי המוות התאיים המתוכנתים המוגדרים גנטית המעורבים באיזון פנימי ובמחלות1.
Pyroptosis מאופיין על ידי היווצרות של נקבוביות הממברנה ואת שחרורו של תוכן התא. קספזות או גראנזימים פעילים מנתקים גזדרמינים כדי להפריד את תחומי N-terminal שלהם, אשר לאחר מכן אוליגומריים, נקשרים לקרום ויוצרים נקבוביות 2,3,4. נקבובית הגסדרמין מספקת תעלת הפרשה לא טיפוסית על פני קרומי התאים, וכתוצאה מכך תגובות תאים במורד הזרם, כולל שחרור תוכן וזרימת יונים 2,3,4. בסופו של דבר, התאים חווים בסופו של דבר קרע בקרום הפלזמה וליזה פירופטוטית בסיוע נינג'ורין-15. באפופטוזיס, Bax ו-Bak מופעלים יוצרים אוליגומרים על הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה ומשחררים ציטוכרום C, המווסת על ידי איזון בין חלבונים פרואפופטוטיים ואנטי-אפופטוטיים ממשפחת BCL-2, קספזות יוזמות (קספאז-8, -9 ו-10-) וקספזות אפקטור (קספאז-3, -6 ו-7)1,6,7. השינויים המורפולוגיים של אפופטוזיס כוללים דימום ממברנה, התכווצות תאים, פיצול גרעיני, עיבוי כרומטין והיווצרות גוף אפופטוטי 6,8. הקולטן סרין/תראונין-פרוטאין קינאז 1 (RIPK3) וקינאז דמוי שושלת מעורבת (MLKL) הם שני מרכיבי ליבה במורד הזרם של מנגנון נקרופטוטי1. RIPK3 מגייס ופוספורילטים MLKL, p-MLKL אוליגומריזציה, מתקשר לקרום התא, יוזם נקבים בממברנה, גורם לזרם יונים, מגביר אוסמולריות תוך תאית, ובסופו של דבר קרע תאים 6,9. Gasdermins ו- MLKL נקשרים לקרום הפלזמה ומתווכים פירופטוזיס ונקרופטוזיס, בהתאמה, בעוד BAX/BAK מתווך אפופטוזיס על ידי קשירה לקרום החיצוני של מיטוכונדריה6.
למרות שלכל מסלול יש מנגנונים ותוצאות ספציפיים, הם מובילים לשינויים דומים על קרום התא. בנסיבות רגילות, פוספטידיל-סרין (PS) ממוקם רק בעלון הפנימי של קרום הפלזמה. עם זאת, בשלבים המוקדמים של פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס, PS ייחשף, מחוץ לקרום הפלזמה. Caspase-3/caspase-7 מפעיל משפחות TMEM16 ו-XKR, מה שמוביל לקרום תא אסימטרי ומחצין PS במהלך אפופטוזיס10. זרם Ca2+ בתיווך D של Gasdermin ו- MLKL מוביל לאובדן הסימטריה של דו-שכבת הפוספוליפידים על קרום התא ולחשיפה של PS. החשיפה מתרחשת לפני אובדן שלמות קרום התא11,12. בהתבסס על השינויים הדומים בממברנה של שלושת הסוגים האלה של מוות תאי מתוכנת, אנו משתמשים בציטומטריית זרימה כדי לנתח צביעה כפולה של Annexin V/7-Aminoactinomycin D (7-AAD) כדי לזהות מוות תאי. Annexin V, חלבון קושר פוספוליפידים תלוי סידן, יש זיקה גבוהה PS, אשר יכול לשמש בדיקה רגישה כדי לזהות PS חשוף על פני השטח של קרום פלזמה13. 7-AAD הוא כתם חומצת גרעין שאינו יכול לעבור דרך כל קרום התא. הוא דומה לפרופידיום יודיד (PI), צבע נפוץ של חומצות גרעין. יש להם מאפיינים פלואורסצנטיים דומים, אך ל-7-AAD יש ספקטרום פליטה צר יותר ופחות הפרעות לערוצי גילוי אחרים. בשל קווי דמיון אלה, אין זה מספיק להבחין בין פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס. השתמשנו בציטומטריית זרימה כדי לזהות מוות תאי מתאים שלמים. שיטה שנייה משמשת ללכידת קרום התא באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כדי לבחון את הצורות האפשריות של מוות תאי בתאים בודדים.
הקמנו מודל ליפופוליסכריד (LPS) ואדנוזין טריפוספט (ATP) המושרה על ידי פורבול-12-מיריסטט-13-אצטט (PMA) - שיקוע שומנים ממוין במונוציטים אנושיים (THP-1) מקרופאגים כדי לצפות במוות תאי. פרוטוקול זה מתמקד בהתבוננות במוות תאי ולא בחקירת מנגנונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)</td>
			<td>BOSTER Biological Technology co.ltd</td>
			<td>PYG0068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd.&#160;</td>
			<td>BS-50-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate&#160;</td>
			<td>Sorfa Life Science Research Co.,Ltd</td>
			<td>220100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit</td>
			<td>Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd</td>
			<td>abs50007</td>
			<td>Annexin V-PE, 7-AAD, 5&#215;Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>celculture CO2 incubator</td>
			<td>Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish, 100 mm</td>
			<td>Sorfa Life Science Research Co.,Ltd</td>
			<td>230301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience LLC</td>
			<td>Cellometer K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer SD100 Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom Bioscience LLC</td>
			<td>CHT4-SD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge machine</td>
			<td>Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd</td>
			<td>L530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromium alum&#160;</td>
			<td>Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>PA04354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses, 9 mm</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd.&#160;</td>
			<td>BS-09-RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>critical point dryer</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>BOSTER Biological Technology co.ltd</td>
			<td>PYG0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electron microscope fixative</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>G1102</td>
			<td>2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electronic balance</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>ATX124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol absolute</td>
			<td>Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2021033102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>FACSCanto <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66831/66831eq01.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometry analysis software</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>BD FACSDivaTM Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin</td>
			<td>Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>PA00256&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution cold field emission scanning electron microscope</td>
			<td>TITACHI</td>
			<td>Regulus 8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human monocytic cell line THP-1</td>
			<td>Procell Life Science&#38;Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>CL0233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems Co., Ltd</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Vortex Mixer</td>
			<td>VELP Scientifica Srl</td>
			<td>ZX4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipopolysaccharide&#160;</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>L8880</td>
			<td>LPS is derived from Escherichia coli 055:B5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>A8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol-12-myristate-13-acetate&#160;</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>P6741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>T-10PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips, 1 mL&#160;</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>T-1250L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>T-200L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 complete culture media</td>
			<td>Procell Life Science&#38;Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>CM0233</td>
			<td>RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM &#946;-mercaptoethanol + 1% P/S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 culture media&#160;</td>
			<td>Shanghai&#160;BasalMedia&#160;Technologies Co., LTD.</td>
			<td>K211104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sheath fluid</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>8546733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sputter coater</td>
			<td>Cressington Scientific Instruments Ltd</td>
			<td>108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermostatic water bath</td>
			<td>GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd&#160;</td>
			<td>HH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lps and atp-induced death of pma-differentiated thp-1 macrophages and its validation

מוות תאי הוא תהליך בסיסי בכל האורגניזמים החיים. הפרוטוקול מבסס מודל ליפופוליסכריד (LPS) ואדנוזין טריפוספט (ATP) המושרה על ידי פורבול-12-מיריסטט-13-אצטט (PMA)-תצהיר שומנים ממוין במונוציטים אנושיים (THP-1) מקרופאגים כדי לצפות במוות תאי. LPS בשילוב עם ATP היא שיטת השראת דלקת קלאסית, המשמשת לעתים קרובות לחקר פירופטוזיס, אך אפופטוזיס ונקרופטוזיס מגיבים גם לגירוי על ידי LPS/ATP. בנסיבות רגילות, פוספטידיל-סרין ממוקם רק בעלון הפנימי של קרום הפלזמה. עם זאת, בשלבים המוקדמים של פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס, קרום התא נשאר שלם וחשוף לפוספטידיל-סרין, ובשלבים מאוחרים יותר, קרום התא מאבד את שלמותו. כאן, ציטומטריית זרימה שימשה לניתוח צביעה כפולה של Annexin V ו- 7-Aminoactinomycin D (AAD) כדי לזהות את מוות התאים מכל התאים. התוצאות מראות כי תאים משמעותיים מתו לאחר גירוי עם LPS/ATP. באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, אנו צופים בצורות האפשריות של מוות תאי בתאים בודדים. התוצאות מצביעות על כך שתאים עשויים לעבור פירופטוזיס, אפופטוזיס או נקרופטוזיס לאחר גירוי עם LPS/ATP. פרוטוקול זה מתמקד בצפייה במוות של מקרופאגים לאחר גירוי באמצעות LPS/ATP. התוצאות הראו כי מוות תאי לאחר גירוי LPS ו-ATP אינו מוגבל לפירופטוזיס, וכי אפופטוזיס ואפופטוזיס נמק יכולים להתרחש גם כן, מה שעוזר לחוקרים להבין טוב יותר את מוות התאים לאחר גירוי LPS ו-ATP ולבחור שיטה ניסיונית טובה יותר.

Cell death is a fundamental physiological process in all living organisms. In recent years, substantial studies have shown that cell death is involved in the immunity and balance within the organism. Studying cell death helps us better understand the onset and development of diseases. Several forms of programmed cell death have been described, and some key targets in these processes have been identified. Pyroptosis, apoptosis, and necroptosis are the three genetically defined programmed cell death pathways involved in internal balance and disease1.
Pyroptosis is characterized by the formation of membrane pores and the release of cell contents. Activated caspases or granzymes cleave gasdermins to separate their N-terminal domains, which then oligomerize, bind to the membrane, and form pores2,3,4. The gasdermin pore provides an atypical secretion channel across cellular membranes, resulting in downstream cell responses, including content release and ion influx2,3,4. Ultimately, the cells eventually experience plasma membrane rupture and pyroptotic lysis facilitated by ninjurin-15. In apoptosis, activated Bax and Bak form oligomers on the mitochondrial outer membrane and release cytochrome C, which is regulated by a balance between proapoptotic and antiapoptotic proteins of the BCL-2 family, initiator caspases (caspase-8, -9 and -10) and effector caspases (caspase-3, -6 and -7)1,6,7. The morphological changes of apoptosis include membrane blebbing, cell shrinkage, nuclear fragmentation, chromatin condensation, and apoptotic body formation6,8. The receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1 (RIPK3) and mixed-lineage kinase domain-like (MLKL) are two downstream core components of the necroptotic mechanism1. RIPK3 recruits and phosphorylates MLKL, p-MLKL oligomerizes, associates with the cell membrane, initiates membrane perforations, causes ion influx, increases intracellular osmolarity, and eventually cell rupture6,9. Gasdermins and MLKL bind to the plasma membrane and mediate pyroptosis and necroptosis, respectively, while BAX/BAK mediates apoptosis by binding to the outer membrane of mitochondria6.
Although each pathway has specific mechanisms and outcomes, they lead to similar changes on the cell membrane. Under normal circumstances, phosphatidylserine (PS) is only localized in the inner leaflet of the plasma membrane. However, in the early stages of pyroptosis, apoptosis, and necroptosis, PS will be exposed, outside of the plasma membrane. Caspase-3/caspase-7 activates TMEM16 and XKR families, which leads to an asymmetrical cell membrane and externalizes&#160;PS during apoptosis10. Gasdermin D-mediated and MLKL-mediated Ca2+ influx leads to loss of the symmetry of the phospholipid bilayer on the cell membrane and the exposure of PS. The exposure occurs before the loss of cell membrane integrity11,12. Based on the similar changes in the membrane of these three types of programmed cell death, we use flow cytometry to analyze Annexin V/7-Aminoactinomycin D (7-AAD) double staining to detect cell death. Annexin V, a calcium-dependent phospholipid-binding protein, has a high affinity for PS, which can serve as a sensitive probe to detect exposed PS on the surface of the plasma membrane13. 7-AAD is a nucleic acid stain that cannot pass through the entire cell membrane. It is similar to propidium iodide (PI), a commonly used nucleic acid dye. They have similar fluorescence characteristics, but 7-AAD has a narrower emission spectrum and less interference with other detection channels. Owing to these similarities, it is not sufficient to distinguish between pyroptosis, apoptosis, and necroptosis. We used flow cytometry to detect the cell death from whole cells. A second method is used to capture the cell membrane using scanning electron microscopy (SEM) to observe the possible forms of cell death in individual cells.
We established a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)-differentiated lipid deposition in human monocyte (THP-1) macrophage model to observe cell death. This protocol focuses on observing cell death rather than investigating mechanisms.

מחבר זרקור: תגובת מקרופאגים THP-1 ל-LPS/ATP — חשיפת ספקטרום פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס

LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA ותיקופו

We are addressing LPS and ATP-introduced deaths of PMA-differentiated THP-1 macrophages. LPS and ATP-introduced deaths are not limited to pryoptosis but apoptosis and necroptosis can also occur. This will aid in a better understanding of cell death after LPS and ATP stimulation, and choosing more suitable experimental methods.Cryo-EM technology many studies the other structures in tissues, cells, and microorganisms. Cryo-EM provides neo native structure data for diverse molecular complexes. For example, using Cryo-Em techniques to perform 3D reconstruction can help us further understand the characteristic of apoptotic and necroptotic parts.Although pryoptosis is considered dominate in LPS and ATP-introduced cell death, one cannot determine the appropriation of these death forms or whether they all exist. Validating diverse cell death and measuring them will be our area of investigation in the future.

דגימות התאים טופלו כמתואר בפרוטוקול ונעשה זיהוי ציטומטריית זרימה. לא ניתן להכתים תאים רגילים בנספח V וב-7-AAD (נספח V-/7-AAD-). בשלבים המוקדמים של פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס, PS נחשף ונקשר לנספחין V, אך קרום התא עדיין היה שלם ולא כלל 7-AAD מהחלל החוץ-תאי (Annexin V+/7-AAD-). בשלבים מאוחרים יותר, קרום התא ...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: THP-1 Macrophage Response to LPS/ATP - Unveiling Pyroptosis, Apoptosis and Necroptosis Spectrum at JoVE.com

פרוטוקול זה מבוסס על LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA. אנו משתמשים בציטומטריית זרימה כדי לנתח צביעה כפולה של Annexin V ו-7-AAD כדי לזהות מוות תאי, תוך שימוש בתא כולו ושימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לצפות במורפולוגיה של קרום התא.

Cell death is a fundamental process in all living organisms. The protocol establishes a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced ...

אנו מטפלים במקרי מוות כתוצאה מ-LPS ו-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים באמצעות PMA. מקרי מוות כתוצאה מ-LPS ו-ATP אינם מוגבלים לפריאופטוזיס, אך אפופטוזיס ונקרופטוזיס יכולים להתרחש גם כן. זה יסייע בהבנה טובה יותר של מוות תאי לאחר גירוי LPS ו- ATP, ובחירת שיטות ניסוי מתאימות יותר.טכנולוגיית Cryo-EM חוקרת רבות את המבנים האחרים ברקמות, תאים ומיקרואורגניזמים. Cryo-EM מספק נתוני מבנה ניאו-טבעי עבור קומפלקסים מולקולריים מגוונים. לדוגמה, שימוש בטכניקות Cryo-Em לביצוע שחזור תלת-ממדי יכול לעזור לנו להבין עוד יותר את המאפיין של חלקים אפופטוטיים ונקרופטוטיים.למרות שפריאופטוזיס נחשב דומיננטי ב-LPS ובמוות תאי ATP, לא ניתן לקבוע את הניכוס של צורות המוות הללו או אם כולן קיימות. אימות מוות תאי מגוון ומדידתם יהיו תחום המחקר שלנו בעתיד.

LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA ותיקופו

Abstract