LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA ותיקופו

Summary

פרוטוקול זה מבוסס על LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA. אנו משתמשים בציטומטריית זרימה כדי לנתח צביעה כפולה של Annexin V ו-7-AAD כדי לזהות מוות תאי, תוך שימוש בתא כולו ושימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לצפות במורפולוגיה של קרום התא.

Abstract

מוות תאי הוא תהליך בסיסי בכל האורגניזמים החיים. הפרוטוקול מבסס מודל ליפופוליסכריד (LPS) ואדנוזין טריפוספט (ATP) המושרה על ידי פורבול-12-מיריסטט-13-אצטט (PMA)-תצהיר שומנים ממוין במונוציטים אנושיים (THP-1) מקרופאגים כדי לצפות במוות תאי. LPS בשילוב עם ATP היא שיטת השראת דלקת קלאסית, המשמשת לעתים קרובות לחקר פירופטוזיס, אך אפופטוזיס ונקרופטוזיס מגיבים גם לגירוי על ידי LPS/ATP. בנסיבות רגילות, פוספטידיל-סרין ממוקם רק בעלון הפנימי של קרום הפלזמה. עם זאת, בשלבים המוקדמים של פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס, קרום התא נשאר שלם וחשוף לפוספטידיל-סרין, ובשלבים מאוחרים יותר, קרום התא מאבד את שלמותו. כאן, ציטומטריית זרימה שימשה לניתוח צביעה כפולה של Annexin V ו- 7-Aminoactinomycin D (AAD) כדי לזהות את מוות התאים מכל התאים. התוצאות מראות כי תאים משמעותיים מתו לאחר גירוי עם LPS/ATP. באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, אנו צופים בצורות האפשריות של מוות תאי בתאים בודדים. התוצאות מצביעות על כך שתאים עשויים לעבור פירופטוזיס, אפופטוזיס או נקרופטוזיס לאחר גירוי עם LPS/ATP. פרוטוקול זה מתמקד בצפייה במוות של מקרופאגים לאחר גירוי באמצעות LPS/ATP. התוצאות הראו כי מוות תאי לאחר גירוי LPS ו-ATP אינו מוגבל לפירופטוזיס, וכי אפופטוזיס ואפופטוזיס נמק יכולים להתרחש גם כן, מה שעוזר לחוקרים להבין טוב יותר את מוות התאים לאחר גירוי LPS ו-ATP ולבחור שיטה ניסיונית טובה יותר.

Introduction

מוות תאי הוא תהליך פיזיולוגי בסיסי בכל האורגניזמים החיים. בשנים האחרונות, מחקרים משמעותיים הראו כי מוות תאי מעורב בחסינות ובאיזון בתוך האורגניזם. חקר מוות תאי עוזר לנו להבין טוב יותר את הופעתן והתפתחותן של מחלות. תוארו מספר צורות של מוות תאי מתוכנת, וכמה מטרות מפתח בתהליכים אלה זוהו. פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס הם שלושת מסלולי המוות התאיים המתוכנתים המוגדרים גנטית המעורבים באיזון פנימי ובמחלות¹.

Pyroptosis מאופיין על ידי היווצרות של נקבוביות הממברנה ואת שחרורו של תוכן התא. קספזות או גראנזימים פעילים מנתקים גזדרמינים כדי להפריד את תחומי N-terminal שלהם, אשר לאחר מכן אוליגומריים, נקשרים לקרום ויוצרים נקבוביות

Protocol

1. קו תאים ותרבית תאים

1. לגדל את קו התאים המונוציטיים האנושיים THP-1 בתווך תרבית שלם RPMI-1640 עם 10% נסיוב בקר עוברי, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-0.05 מילימטר β-מרקפטואתנול. תרבית את התאים ב 37 ° C ב 5% CO₂ אוויר לח. תאי תרבית כל 2-3 ימים.
   הערה: THP-1 הוא תא תרחיף, בחר לשנות מחצית מהמדיום עבור תת.......

Discussion

בכתב יד זה, שתי שיטות שימשו לזיהוי LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA. נעשה שימוש בצביעה כפולה של Annexin V/7-AAD, והתוצאות נותחו על ידי ציטומטריית זרימה מהצביעה הכוללת. כמו באנליזה ציטומטרית זרימה אחרת, קבוצה של תאים לא מוכתמים ושתי קבוצות של תאים מוכתמים בודדים הוקמו כדי לא לכלול תו.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	CORNING	352235
5 mL centrifuge tube	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-50-M
6-well plate	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit	Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd	abs50007	Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubator	Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.	N/A
cell culture dish, 100 mm	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 Counting Chambers	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
centrifuge machine	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd	L530
chromium alum	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA04354
cover glasses, 9 mm	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-09-RC
critical point dryer	Quorum Technologies	K850
dimethyl sulfoxide	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0040
electron microscope fixative	Servicebio Technology co.ltd	G1102	2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balance	SHIMADZU	ATX124
ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021033102
flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCanto
flow cytometry analysis software	Becton,Dickinson and Company	BD FACSDivaTM Software
gelatin	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA00256
High resolution cold field emission scanning electron microscope	TITACHI	Regulus 8100
human monocytic cell line THP-1	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CL0233
inverted microscope	Leica Microsystems Co., Ltd	DMi1
IR Vortex Mixer	VELP Scientifica Srl	ZX4
lipopolysaccharide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	L8880	LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATP	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P6741
phosphate-buffered saline	Servicebio Technology co.ltd	G4202
Pipette	Eppendorf AG	N/A
pipette tips, 10 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-10PL
pipette tips, 1 mL	Servicebio Technology co.ltd	T-1250L
pipette tips, 200 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-200L
RPMI-1640 complete culture media	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media	Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.	K211104
sheath fluid	BECKMAN COULTER	8546733
sputter coater	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
thermostatic water bath	GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd	HH-1