Morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA e sua validação

Summary

Este protocolo é baseado na morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Usamos citometria de fluxo para analisar a coloração dupla de Anexina V e 7-AAD para detectar morte celular, usando a célula inteira e empregando microscopia eletrônica de varredura para observar a morfologia da membrana celular.

Abstract

A morte celular é um processo fundamental em todos os organismos vivos. O protocolo estabelece um modelo de deposição lipídica diferenciada de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) em modelo de macrófago de monócitos humanos (THP-1) para observar a morte celular. O LPS combinado com ATP é um método clássico de indução inflamatória, frequentemente usado para estudar a piroptose, mas a apoptose e a necroptose também respondem à estimulação por LPS/ATP. Em circunstâncias normais, a fosfatidilserina está localizada apenas no folheto interno da membrana plasmática. No entanto, nos estágios iniciais de piroptose, apoptose e necroptose, a membrana celular permanece intacta e exposta à fosfatidilserina e, nos estágios posteriores, a membrana celular perde sua integridade. Aqui, a citometria de fluxo foi usada para analisar a coloração dupla de Anexina V e 7-Aminoactinomicina D (AAD) para detectar a morte celular de células inteiras. Os resultados mostram que células substanciais morreram após estimulação com LPS / ATP. Usando microscopia eletrônica de varredura, observamos as possíveis formas de morte celular em células individuais. Os resultados indicam que as células podem sofrer piroptose, apoptose ou necroptose após estimulação com LPS/ATP. Este protocolo tem como foco observar a morte de macrófagos após estimulação com LPS/ATP. Os resultados mostraram que a morte celular após a estimulação de LPS e ATP não se limita à piroptose e que a apoptose e a apoptose necrótica também podem ocorrer, ajudando os pesquisadores a entender melhor a morte celular após a estimulação de LPS e ATP e escolher um método experimental melhor.

Introduction

A morte celular é um processo fisiológico fundamental em todos os organismos vivos. Nos últimos anos, estudos substanciais mostraram que a morte celular está envolvida na imunidade e no equilíbrio dentro do organismo. Estudar a morte celular nos ajuda a entender melhor o início e o desenvolvimento de doenças. Várias formas de morte celular programada foram descritas, e alguns alvos-chave nesses processos foram identificados. Piroxase, apoptose e necroptose são as três vias de morte celular programada geneticamente definidas envolvidas no equilíbrio interno e na doença¹.

A piroptose é caracterizada pela formação de po....

Protocol

1. Linhagem celular e cultura celular

1. Cultive a linha celular monocítica humana THP-1 em meio de cultura completo RPMI-1640 com 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina e 0,05 mM de β-mercaptoetanol. Cultive as células a 37 ° C em ar umidificado com 5% de CO₂ . Subcultura de células a cada 2-3 dias.
   NOTA: THP-1 é uma célula de suspensão, selecione para alterar metade do meio para subcultura. Ao observar muitos fragmentos de células ao microscópio óptico.......

Discussion

Neste manuscrito, dois métodos foram usados para detectar a morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. A dupla coloração com anexina V/7-AAD foi usada, e os resultados foram analisados por citometria de fluxo da coloração global. Tal como acontece com outras análises de citometria de fluxo, um grupo de células não coradas e dois grupos de células coradas simples foram configurados para excluir resultados falsos positivos e falsos negativos. Os resultados mostram que após a estimula.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	CORNING	352235
5 mL centrifuge tube	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-50-M
6-well plate	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit	Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd	abs50007	Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubator	Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.	N/A
cell culture dish, 100 mm	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 Counting Chambers	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
centrifuge machine	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd	L530
chromium alum	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA04354
cover glasses, 9 mm	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-09-RC
critical point dryer	Quorum Technologies	K850
dimethyl sulfoxide	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0040
electron microscope fixative	Servicebio Technology co.ltd	G1102	2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balance	SHIMADZU	ATX124
ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021033102
flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCanto
flow cytometry analysis software	Becton,Dickinson and Company	BD FACSDivaTM Software
gelatin	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA00256
High resolution cold field emission scanning electron microscope	TITACHI	Regulus 8100
human monocytic cell line THP-1	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CL0233
inverted microscope	Leica Microsystems Co., Ltd	DMi1
IR Vortex Mixer	VELP Scientifica Srl	ZX4
lipopolysaccharide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	L8880	LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATP	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P6741
phosphate-buffered saline	Servicebio Technology co.ltd	G4202
Pipette	Eppendorf AG	N/A
pipette tips, 10 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-10PL
pipette tips, 1 mL	Servicebio Technology co.ltd	T-1250L
pipette tips, 200 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-200L
RPMI-1640 complete culture media	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media	Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.	K211104
sheath fluid	BECKMAN COULTER	8546733
sputter coater	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
thermostatic water bath	GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd	HH-1