Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Этот протокол основан на ЛПС и АТФ-индуцированной гибели PMA-дифференцированных макрофагов THP-1. Мы используем проточную цитометрию для анализа аннексина V и двойное окрашивание 7-AAD для выявления гибели клеток, используя всю клетку и сканирующую электронную микроскопию для наблюдения за морфологией клеточной мембраны.

Abstract

Гибель клеток является фундаментальным процессом во всех живых организмах. Протокол устанавливает индуцированное липополисахаридом (ЛПС) и аденозинтрифосфатом (АТФ) дифференцированное отложение липидов в модели моноцитов человека (ТГП-1) для наблюдения за гибелью клеток. ЛПС в сочетании с АТФ является классическим методом индукции воспаления, часто используемым для изучения пироптоза, но апоптоз и некроптоз также реагируют на стимуляцию ЛПС/АТФ. В нормальных условиях фосфатидилсерин локализуется только во внутреннем листке плазматической мембраны. Однако на ранних стадиях пироптоза, апоптоза и некроптоза клеточная мембрана остается неповрежденной и подвергается воздействию фосфатидилсерина, а на более поздних стадиях клеточная мембрана теряет свою целостность. Здесь с помощью проточной цитометрии анализировали двойное окрашивание аннексина V и 7-аминоактиномицина D (AAD) с целью выявления гибели целых клеток. Результаты показывают, что значительные клетки погибли после стимуляции ЛПС/АТФ. С помощью сканирующей электронной микроскопии мы наблюдаем возможные формы клеточной гибели в отдельных клетках. Результаты показывают, что клетки могут подвергаться пироптозу, апоптозу или некроптозу после стимуляции ЛПС/АТФ. Этот протокол направлен на наблюдение за гибелью макрофагов после стимуляции ЛПС/АТФ. Результаты показали, что гибель клеток после стимуляции ЛПС и АТФ не ограничивается пироптозом и что апоптоз и некротический апоптоз также могут происходить, что помогает исследователям лучше понять гибель клеток после стимуляции ЛПС и АТФ и выбрать лучший экспериментальный метод.

Introduction

Гибель клеток является фундаментальным физиологическим процессом во всех живых организмах. В последние годы серьезные исследования показали, что гибель клеток влияет на иммунитет и баланс в организме. Изучение клеточной смерти помогает нам лучше понять возникновение и развитие заболеваний. Было описано несколько форм запрограммированной клеточной смерти, и были определены некоторые ключевые мишени в этих процессах. Пироптоз, апоптоз и некроптоз являются тремя генетически определенными запрограммированными путями гибели клеток, участвующими во внутреннем балансеи заболевании.

Пироптоз характеризуется образованием мемб....

Protocol

1. Клеточная линия и клеточная культура

  1. Выращивание моноцитарной клеточной линии человека THP-1 в питательной среде RPMI-1640 с 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллин-стрептомицина и 0,05 мМ β-меркаптоэтанола. Культивируйте клетки при температуре 37 °C в увлажненном воздухе с .......

Representative Results

Образцы клеток обрабатывались в соответствии с описанием протокола и проводилась проточная цитометрия. Нормальные клетки нельзя окрашивать Аннексином V и 7-AAD (Аннексин V-/7-AAD-). На ранних стадиях пироптоза, апоптоза и некроптоза PS подвергался воздействию и связывался с аннексином V, но кл.......

Discussion

В данной рукописи были использованы два метода для выявления ЛПС и АТФ-индуцированной гибели РМА-дифференцированных макрофагов ТГП-1. Использовали двойное окрашивание аннексином V/7-AAD, результаты которого анализировали с помощью проточной цитометрии из общего окрашивания. Как и при др.......

Acknowledgements

Выражаем огромную благодарность Цзяи Сунь и Лу Яну из Инновационного института китайской медицины и фармации Университета традиционной китайской медицины Чэнду за помощь в проведении проточной цитометрии, Цуйпин Чэню из Государственной ключевой лаборатории ресурсов юго-западной китайской медицины за помощь в проведении сканирующей электронной микроскопии. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая [82104491], Фондом естественных наук провинции Сычуань [2023NSFSC0674] и Фондом постдокторантуры Китая [2021M693789].

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)BOSTER Biological Technology co.ltdPYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom TubeCORNING352235
5 mL centrifuge tubeLabgic Technology Co., Ltd. BS-50-M
6-well plate Sorfa Life Science Research Co.,Ltd220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kitAbsin (Shanghai) Biological Technology co.ltdabs50007Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubatorEsco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.N/A
cell culture dish, 100 mmSorfa Life Science Research Co.,Ltd230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell CounterNexcelom Bioscience LLCCellometer K2
Cellometer SD100 Counting ChambersNexcelom Bioscience LLCCHT4-SD100-002
centrifuge machineHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., LtdL530
chromium alum Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.PA04354
cover glasses, 9 mmLabgic Technology Co., Ltd. BS-09-RC
critical point dryerQuorum TechnologiesK850
dimethyl sulfoxideBOSTER Biological Technology co.ltdPYG0040
electron microscope fixativeServicebio Technology co.ltd G11022.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balanceSHIMADZUATX124
ethanol absoluteChengdu Kelong Chemical Co., Ltd2021033102
flow cytometerBecton,Dickinson and CompanyFACSCanto figure-materials-2579
flow cytometry analysis softwareBecton,Dickinson and CompanyBD FACSDivaTM Software
gelatinGuangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.PA00256 
High resolution cold field emission scanning electron microscopeTITACHIRegulus 8100
human monocytic cell line THP-1Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.CL0233
inverted microscope Leica Microsystems Co., LtdDMi1
IR Vortex MixerVELP Scientifica SrlZX4
lipopolysaccharide Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. L8880LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATPBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. P6741
phosphate-buffered salineServicebio Technology co.ltd G4202
PipetteEppendorf AGN/A
pipette tips, 10 μLServicebio Technology co.ltd T-10PL
pipette tips, 1 mL Servicebio Technology co.ltd T-1250L
pipette tips, 200 μLServicebio Technology co.ltd T-200L
RPMI-1640 complete culture mediaProcell Life Science&Technology Co.,Ltd.CM0233RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.K211104
sheath fluidBECKMAN COULTER8546733
sputter coaterCressington Scientific Instruments Ltd108
thermostatic water bathGUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd HH-1

References

  1. Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death. Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).
  2. Rao, Z., et al. Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer.

Explore More Articles

1V7 D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved