ЛПС и АТФ-индуцированная гибель PMA-дифференцированных макрофагов THP-1 и ее валидация

Summary

Этот протокол основан на ЛПС и АТФ-индуцированной гибели PMA-дифференцированных макрофагов THP-1. Мы используем проточную цитометрию для анализа аннексина V и двойное окрашивание 7-AAD для выявления гибели клеток, используя всю клетку и сканирующую электронную микроскопию для наблюдения за морфологией клеточной мембраны.

Abstract

Гибель клеток является фундаментальным процессом во всех живых организмах. Протокол устанавливает индуцированное липополисахаридом (ЛПС) и аденозинтрифосфатом (АТФ) дифференцированное отложение липидов в модели моноцитов человека (ТГП-1) для наблюдения за гибелью клеток. ЛПС в сочетании с АТФ является классическим методом индукции воспаления, часто используемым для изучения пироптоза, но апоптоз и некроптоз также реагируют на стимуляцию ЛПС/АТФ. В нормальных условиях фосфатидилсерин локализуется только во внутреннем листке плазматической мембраны. Однако на ранних стадиях пироптоза, апоптоза и некроптоза клеточная мембрана остается неповрежденной и подвергается воздействию фосфатидилсерина, а на более поздних стадиях клеточная мембрана теряет свою целостность. Здесь с помощью проточной цитометрии анализировали двойное окрашивание аннексина V и 7-аминоактиномицина D (AAD) с целью выявления гибели целых клеток. Результаты показывают, что значительные клетки погибли после стимуляции ЛПС/АТФ. С помощью сканирующей электронной микроскопии мы наблюдаем возможные формы клеточной гибели в отдельных клетках. Результаты показывают, что клетки могут подвергаться пироптозу, апоптозу или некроптозу после стимуляции ЛПС/АТФ. Этот протокол направлен на наблюдение за гибелью макрофагов после стимуляции ЛПС/АТФ. Результаты показали, что гибель клеток после стимуляции ЛПС и АТФ не ограничивается пироптозом и что апоптоз и некротический апоптоз также могут происходить, что помогает исследователям лучше понять гибель клеток после стимуляции ЛПС и АТФ и выбрать лучший экспериментальный метод.

Introduction

Гибель клеток является фундаментальным физиологическим процессом во всех живых организмах. В последние годы серьезные исследования показали, что гибель клеток влияет на иммунитет и баланс в организме. Изучение клеточной смерти помогает нам лучше понять возникновение и развитие заболеваний. Было описано несколько форм запрограммированной клеточной смерти, и были определены некоторые ключевые мишени в этих процессах. Пироптоз, апоптоз и некроптоз являются тремя генетически определенными запрограммированными путями гибели клеток, участвующими во внутреннем балансе^и заболевании.

Пироптоз характеризуется образованием мемб....

Protocol

1. Клеточная линия и клеточная культура

1. Выращивание моноцитарной клеточной линии человека THP-1 в питательной среде RPMI-1640 с 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллин-стрептомицина и 0,05 мМ β-меркаптоэтанола. Культивируйте клетки при температуре 37 °C в увлажненном воздухе с .......

Discussion

В данной рукописи были использованы два метода для выявления ЛПС и АТФ-индуцированной гибели РМА-дифференцированных макрофагов ТГП-1. Использовали двойное окрашивание аннексином V/7-AAD, результаты которого анализировали с помощью проточной цитометрии из общего окрашивания. Как и при др.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	CORNING	352235
5 mL centrifuge tube	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-50-M
6-well plate	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit	Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd	abs50007	Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubator	Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.	N/A
cell culture dish, 100 mm	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 Counting Chambers	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
centrifuge machine	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd	L530
chromium alum	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA04354
cover glasses, 9 mm	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-09-RC
critical point dryer	Quorum Technologies	K850
dimethyl sulfoxide	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0040
electron microscope fixative	Servicebio Technology co.ltd	G1102	2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balance	SHIMADZU	ATX124
ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021033102
flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCanto
flow cytometry analysis software	Becton,Dickinson and Company	BD FACSDivaTM Software
gelatin	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA00256
High resolution cold field emission scanning electron microscope	TITACHI	Regulus 8100
human monocytic cell line THP-1	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CL0233
inverted microscope	Leica Microsystems Co., Ltd	DMi1
IR Vortex Mixer	VELP Scientifica Srl	ZX4
lipopolysaccharide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	L8880	LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATP	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P6741
phosphate-buffered saline	Servicebio Technology co.ltd	G4202
Pipette	Eppendorf AG	N/A
pipette tips, 10 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-10PL
pipette tips, 1 mL	Servicebio Technology co.ltd	T-1250L
pipette tips, 200 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-200L
RPMI-1640 complete culture media	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media	Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.	K211104
sheath fluid	BECKMAN COULTER	8546733
sputter coater	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
thermostatic water bath	GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd	HH-1