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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este estudo apresenta um procedimento único de dissecção romba para preservar a integridade da geléia de Wharton (WJ), resultando em WJ menos danificado e uma maior quantidade e viabilidade das células-tronco mesenquimais (MSCs) colhidas. O método demonstra rendimento superior e capacidade proliferativa em comparação com os métodos convencionais de dissecção aguda.

Abstract

As células-tronco mesenquimais (CTMs) são uma população de células multipotentes com propriedades regenerativas e imunomoduladoras notáveis. A geléia de Wharton (WJ) do cordão umbilical (UC) tem ganhado um interesse crescente no campo biomédico como uma excelente fonte de MSCs. No entanto, surgiram desafios como oferta limitada e falta de padronização nos métodos existentes. Este artigo apresenta um novo método para aumentar o rendimento do MSC dissecando WJ intacto do cordão umbilical. O método emprega dissecção romba para remover a camada epitelial, mantendo a integridade de todo o WJ e resultando em um aumento da quantidade e viabilidade das MSCs colhidas. Essa abordagem reduz significativamente o desperdício de WJ em comparação com os métodos convencionais de dissecção aguda. Para garantir a pureza das WJ-MSCs e minimizar a influência celular externa, foi realizado um procedimento utilizando tensão interna para descascar o endotélio após a inversão do UC. Além disso, a placa de Petri foi invertida por um curto período de tempo durante o cultivo de explantes para melhorar a fixação e o crescimento celular. A análise comparativa demonstrou a superioridade do método proposto, mostrando um maior rendimento de WJ e WJ-MSCs com melhor viabilidade do que os métodos tradicionais. A morfologia e o padrão de expressão semelhantes dos marcadores de superfície celular em ambos os métodos confirmam sua caracterização e pureza para várias aplicações. Este método fornece uma abordagem de alto rendimento e alta viabilidade para o isolamento de WJ-MSC, demonstrando grande potencial para a aplicação clínica de MSCs.

Introduction

Desde o primeiro isolamento de células-tronco mesenquimais (MSCs) da geléia de Wharton (WJ) em 1991, essas células-tronco multipotentes ganharam atenção significativa dos pesquisadores devido às suas propriedades regenerativas e capacidade de diferenciação de múltiplas linhagens1. As CTMs podem ser isoladas de várias fontes, incluindo medula óssea, sangue periférico, polpa dentária, tecido adiposo, fetal (aborto humano) e tecidos relacionados ao parto2. O cordão umbilical () tem emergido como um reservatório promissor devido à sua natureza não invasiva, abundante rendimento celular e capacidade de diferenciação, exibindo....

Protocol

As amostras foram obtidas de doadores saudáveis e consentidos do Hospital de Saúde Infantil e Maternidade do Distrito de Shenzhen Longgang, Guangdong, China. O uso de amostras humanas para o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de Shenzhen, Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (SZLDH2020LSYM-095) e Comitê de Ética Médica do Hospital de Maternidade e Saúde Infantil do Distrito de Shenzhen Longgang (LGFYYXLLS-2020-005). Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes aprovad.......

Representative Results

Os procedimentos para coleta e cultura de UC-MSCs, bem como sua análise subsequente, estão resumidos na Figura 1. A UC foi cuidadosamente dissecada em várias seções usando o método único; o diagrama de operação específico dos principais procedimentos é ilustrado na Figura 2. O crescimento de células de culturas de explantes foi rotineiramente monitorado e registrado. Células fusiformes aderentes foram observadas aproximadamente 4 dias após a cultur.......

Discussion

As CTMs representam uma área dinâmica de pesquisa com profundas implicações para a medicina regenerativa22. Suas propriedades únicas os tornam um ponto focal para a investigação científica e têm o potencial de revolucionar o tratamento de uma ampla gama de doenças e lesões7. As WJ-MSCs são um subconjunto distinto de MSCs, que podem ser obtidas do tecido conjuntivo gelatinoso dentro da UC situado entre o epitélio intervascular e amniótico23

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82172107), Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong, China (2021A1515011927, 2021A1515010918, 2020A1515110347), Fundo de Pesquisa Médica de Shenzhen (SMRF. D2301015), o Comitê Municipal de Inovação em Ciência e Tecnologia de Shenzhen (JCYJ20210324135014040, JCYJ20220530172807016, JCYJ20230807150908018, JCYJ20230807150915031) e o Fundo Especial do Distrito de Longgang para o Desenvolvimento Econômico e Tecnológico (LGKCYLWS2022007).

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
APC anti-human CD44 Antibody Biolegend 338806
24-well cell culture platesThermo Scientific142475
APC anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody Biolegend 344006
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) AntibodyBiolegend 400122
AutoclaveHIRAYAMAHVE-50
Automatic Cell CounterCountstarFL-CD
BAMBANKER Cryopreservation SolutionWako302-14681
Cell Staining BufferBiolegend 420201
Centrifugal MachineEppendorf5424R
Clean BenchShanghai ZhiChengC1112B
CO2 IncubatorThermo ScientificHERAcell 150i
D-PBSSolarbioD1040
Electro- thermostatic Blast OvenShanghai JingHongDHG-9423A
FITC anti-human CD105 Antibody Biolegend 323204
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody Biolegend 328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) AntibodyBiolegend 400110
Flow CytometryBeckmanCytoFLEX
hemocytometerSuperior Marienfeld640410
Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10×) Biolegend 421002
Inverted Biological MicroscopeZEISSAxio Vert. A1
Liquid Nitrogen Storage TankThermo ScientificCY50935-70
Normal saline (NS)MeilunbioMA0083
PBSSolarbioP1032
PE anti-human CD11b AntibodyBiolegend 393112
PE anti-human CD19 Antibody Biolegend 392506
PE anti-human CD34 AntibodyBiolegend 343606
PE anti-human CD45 AntibodyBiolegend 368510
PE anti-human HLA-DR Antibody Biolegend 307606
PE Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) AntibodyBiolegend 400114
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl (FC) AntibodyBiolegend 400214
Precision Electronic BalanceSatoriusPRACTUM313-1CN
Snowflake Ice MachineZIEGRAZBE 30-10
steriled 50 mL plastic tubeGreniner227270
Thermostatic Water BathShanghai YiHengHWS12
Trypsin 1:250SolarbioT8150
UltraGRO-AdvancedHelios HPCFDCGL50
Ultrapure and Pure Water Purification SystemMilli-QMilli-Q Reference
Xeno-Free Human MSC Culture MediumFUKOKU T2011301

References

  1. Abbaszadeh, H., et al. Regenerative potential of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: A new horizon of stem cell therapy. J Cell Physiol. 235 (12), 9230-9240 (2020).
  2. Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X.

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