Isolamento de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical com alto rendimento e baixo dano

Summary

Este estudo apresenta um procedimento único de dissecção romba para preservar a integridade da geléia de Wharton (WJ), resultando em WJ menos danificado e uma maior quantidade e viabilidade das células-tronco mesenquimais (MSCs) colhidas. O método demonstra rendimento superior e capacidade proliferativa em comparação com os métodos convencionais de dissecção aguda.

Abstract

As células-tronco mesenquimais (CTMs) são uma população de células multipotentes com propriedades regenerativas e imunomoduladoras notáveis. A geléia de Wharton (WJ) do cordão umbilical (UC) tem ganhado um interesse crescente no campo biomédico como uma excelente fonte de MSCs. No entanto, surgiram desafios como oferta limitada e falta de padronização nos métodos existentes. Este artigo apresenta um novo método para aumentar o rendimento do MSC dissecando WJ intacto do cordão umbilical. O método emprega dissecção romba para remover a camada epitelial, mantendo a integridade de todo o WJ e resultando em um aumento da quantidade e viabilidade das MSCs colhidas. Essa abordagem reduz significativamente o desperdício de WJ em comparação com os métodos convencionais de dissecção aguda. Para garantir a pureza das WJ-MSCs e minimizar a influência celular externa, foi realizado um procedimento utilizando tensão interna para descascar o endotélio após a inversão do UC. Além disso, a placa de Petri foi invertida por um curto período de tempo durante o cultivo de explantes para melhorar a fixação e o crescimento celular. A análise comparativa demonstrou a superioridade do método proposto, mostrando um maior rendimento de WJ e WJ-MSCs com melhor viabilidade do que os métodos tradicionais. A morfologia e o padrão de expressão semelhantes dos marcadores de superfície celular em ambos os métodos confirmam sua caracterização e pureza para várias aplicações. Este método fornece uma abordagem de alto rendimento e alta viabilidade para o isolamento de WJ-MSC, demonstrando grande potencial para a aplicação clínica de MSCs.

Introduction

Desde o primeiro isolamento de células-tronco mesenquimais (MSCs) da geléia de Wharton (WJ) em 1991, essas células-tronco multipotentes ganharam atenção significativa dos pesquisadores devido às suas propriedades regenerativas e capacidade de diferenciação de múltiplas linhagens¹. As CTMs podem ser isoladas de várias fontes, incluindo medula óssea, sangue periférico, polpa dentária, tecido adiposo, fetal (aborto humano) e tecidos relacionados ao parto². O cordão umbilical () tem emergido como um reservatório promissor devido à sua natureza não invasiva, abundante rendimento celular e capacidade de diferenciação, exibindo....

Protocol

As amostras foram obtidas de doadores saudáveis e consentidos do Hospital de Saúde Infantil e Maternidade do Distrito de Shenzhen Longgang, Guangdong, China. O uso de amostras humanas para o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de Shenzhen, Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (SZLDH2020LSYM-095) e Comitê de Ética Médica do Hospital de Maternidade e Saúde Infantil do Distrito de Shenzhen Longgang (LGFYYXLLS-2020-005). Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes aprovad.......

Discussion

As CTMs representam uma área dinâmica de pesquisa com profundas implicações para a medicina regenerativa²². Suas propriedades únicas os tornam um ponto focal para a investigação científica e têm o potencial de revolucionar o tratamento de uma ampla gama de doenças e lesões⁷. As WJ-MSCs são um subconjunto distinto de MSCs, que podem ser obtidas do tecido conjuntivo gelatinoso dentro da UC situado entre o epitélio intervascular e amniótico²³

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-human CD44 Antibody	Biolegend	338806
24-well cell culture plates	Thermo Scientific	142475
APC anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	Biolegend	344006
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400122
Autoclave	HIRAYAMA	HVE-50
Automatic Cell Counter	Countstar	FL-CD
BAMBANKER Cryopreservation Solution	Wako	302-14681
Cell Staining Buffer	Biolegend	420201
Centrifugal Machine	Eppendorf	5424R
Clean Bench	Shanghai ZhiCheng	C1112B
CO2 Incubator	Thermo Scientific	HERAcell 150i
D-PBS	Solarbio	D1040
Electro- thermostatic Blast Oven	Shanghai JingHong	DHG-9423A
FITC anti-human CD105 Antibody	Biolegend	323204
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	Biolegend	328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400110
Flow Cytometry	Beckman	CytoFLEX
hemocytometer	Superior Marienfeld	640410
Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10×)	Biolegend	421002
Inverted Biological Microscope	ZEISS	Axio Vert. A1
Liquid Nitrogen Storage Tank	Thermo Scientific	CY50935-70
Normal saline (NS)	Meilunbio	MA0083
PBS	Solarbio	P1032
PE anti-human CD11b Antibody	Biolegend	393112
PE anti-human CD19 Antibody	Biolegend	392506
PE anti-human CD34 Antibody	Biolegend	343606
PE anti-human CD45 Antibody	Biolegend	368510
PE anti-human HLA-DR Antibody	Biolegend	307606
PE Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400114
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400214
Precision Electronic Balance	Satorius	PRACTUM313-1CN
Snowflake Ice Machine	ZIEGRA	ZBE 30-10
steriled 50 mL plastic tube	Greniner	227270
Thermostatic Water Bath	Shanghai YiHeng	HWS12
Trypsin 1:250	Solarbio	T8150
UltraGRO-Advanced	Helios	HPCFDCGL50
Ultrapure and Pure Water Purification System	Milli-Q	Milli-Q Reference
Xeno-Free Human MSC Culture Medium	FUKOKU	T2011301