De auteurs erkennen het H2020-programma van de Europese Unie (project GAIN4CROPS, GA nr. 862087). Het Centre of Excellence AgroCropFuture Agroecology and new crops in future climates wordt gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs en Onderzoek, Estland. We willen professor Evelin Loit-Harro bedanken voor het leveren van zaden van T. aestivum en Z. mays, Paula Palmet en Vaiko Vainola voor hun hulp bij het voorbereiden van bladdoorsneden, en João Paulo de Silva Souza voor hulp bij de analyse. Alle beelden zijn verkregen van de microscopie-eenheid van de Estse Universiteit voor Levenswetenschappen in het kader van verschillende projecten.

1. Omstandigheden voor plantengroei
<ol><li>Selecteer tarwe (Triticum aestivum L. Var. Winter Wheat, "Fredis") en maïs (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam") als representatieve C3 - en C4-planten . Kweek beide plantensoorten in een omgevingsgecontroleerde groeikamer uit zaden.</li>
	<li>Houd de relatieve luchtvochtigheid op 55% met een luchttemperatuur van 25 °C/18 °C (dag/nacht) met een lichtperiode van 12 uur. Handhaaf de fotosynthetische fotonfluxd...

Microscopische analyse voor het verbeteren van de fotosynthese-efficiëntie in C4-gewassen

In dit artikel bespreken we zowel de kwantitatieve als kwalitatieve methoden voor het meten van de anatomie van bladeren en de manieren waarop deze kunnen worden geoptimaliseerd. Bovendien wordt de methodologie toegepast op representatieve gewassoorten om te bepalen welke anatomische kenmerken het nuttigst zijn om onderscheid te maken tussen C3- en C 4-doorsneden. Het begrijpen van deze eigenschappen is essentieel, aangezien hybride soorten, genaamdC2-fotosynthese, een veelbelovender onde...

Fotosynthese is een fundamenteel proces waarbij lichtenergie wordt omgezet in chemische energie, die dient als hoeksteen van terrestrische trofische netwerken. De meeste planten volgen deC3-route van fotosynthese, waarbij het primaire fotosynthetische product de drie-koolstofverbinding glyceraat 3-fosfaat is. C3 fotosynthese evolueerde meer dan 2 miljard jaar geleden in de atmosfeer, rijk aan CO2 en laag in O21. Het belangrijkste fotosynthetische enzym ribulose 1,5-bisfosfaatcarboxylase/oxygenase (Rubisco), dat onder deze omstandigheden is geëvolueerd, is suboptimaal voor de huidige omstandigheden met een laag CO2 hoog O2-gehalte, omdat het competitief reageert met O2, waardoor fotorespiratie wordt geïnitieerd2. Fotorespiratie is een verspillende route die energie verbruikt in plaats van deze te produceren en CO2 als bijproduct vrij te geven. Daarom is het van cruciaal belang om een hoge CO2 -concentratie rond Rubisco in chloroplasten te handhaven om oxygenatie te voorkomen 3,4. Vanwege het onvermogen vanC3-planten om CO2 te concentreren, is er een aanzienlijke CO2 -opname van de omgevingslucht naar chloroplasten, waardoor de fotosynthese wordt afgeremd en de plantengroei en de productie van biomassa worden beïnvloed 2,5,6.
InC3-planten wordt de fotosynthese beperkt door de intrede van CO2 via huidmondjes, de diffusie ervan door het mesofyl en de biochemische activiteit van fotosynthetische enzymen. De opname van CO2 wordt in de eerste plaats beperkt door de stomatale geleiding, die wordt geregeld door omgevingsomstandigheden zoals luchttemperatuur en vochtigheid. Vervolgens diffundeert CO2 door de interne gasvormige en vloeibare fase van het blad naar Rubisco7. In C3-planten vinden alle stadia van fotosynthese plaats in de chloroplasten van mesofylcellen, en planten moeten een constante instroom van CO2 uit de atmosfeer in chloroplasten behouden. De afhankelijkheid van de beschikbaarheid van CO2 in chloroplasten van stomatale openheid, mesofylarchitectuur en individuele cel- en chloroplastkenmerken maakt planten vatbaar voor omgevingsbeperkingen die uiteindelijk de fotosynthese beïnvloeden, zoals een lage beschikbaarheid van water en hoge temperaturen 7,8,9,10, wat met name hun kwetsbaarheid voor klimaatverandering benadrukt11.
Gezien de uitdagingen die worden veroorzaakt door de inefficiënties van deC3-route, evenals beperkingen bij het handhaven van optimale CO2 -niveaus en gevoeligheid voor omgevingsfactoren, is in bepaalde planten een andere route, de C4-fotosyntheseroute, geëvolueerd. Kenmerkend is datC4-planten twee ruimtelijk gescheiden biochemische routes hebben; de initiële CO2 -fixatie vindt plaats in mesofylcellen door fosfoenolpyruvaatcarboxylase, dat een hogere affiniteit heeft voor CO2 dan Rubisco en ook geen oxygenatie-activiteit heeft. Het gevormdeC4-product wordt verder getransporteerd naar bundelmantelcellen, waar het wordt gedecarboxyleerd, en CO2 wordt opnieuw vrijgegeven en gefixeerd door Rubisco (C3-fotosynthese)12,13,14. De grotere affiniteit van PEP-carboxylase voor CO2 en dikke celwanden van bundelschedecellen zorgen voor CO2-concentratie in bundelschedecellen, en zo minimaliserenC4-planten de fotorespiratie door CO 2-fixatie en de Calvin-cyclus ruimtelijk te scheiden. De adoptie van de C4-route toont de adaptieve reactie van de natuur op milieubeperkingen en biedt inzicht in mogelijke strategieën voor het verbeteren van de productiviteit en veerkracht van gewassen in veranderende klimaatomstandigheden15.
De gespecialiseerde anatomie van de bladstructuur in C4-planten wordt gekenmerkt door aders omgeven door vergrote vaatbundelschedecellen die chloroplasten bevatten en met een radiale rangschikking van mesofylcellen in een buitenste ringpatroon rond bundelschedecellen. De mesofylcellen bevinden zich in de nabijheid van de bundelschedecellen, wat een snel en continu transport van metabolieten tussen de twee celtypen mogelijk maakt. De rangschikking van deze cel is typerend voor C4-planten en wordt aangeduid als Kranz-anatomie16. BijC3-soorten kan de specialisatie en dispositie van mesofylcellen variëren, maar bundelschedecellen zijn duidelijk kleiner en hebben een paar chloroplasten of helemaal geen chloroplasten. Specifieke Kranz-anatomie maakt het mogelijk om CO2 te concentreren in chloroplasten in bundelschedecellen waar hetC3-carboxylerende enzym Rubisco zich bevindt, waardoor de fotorespiratie effectief wordt belemmerd 4,17,18. Ondanks de schijnbaar complexe rangschikking, hebben deze veranderingen zich onafhankelijk meerdere keren voorgedaan in de evolutie van angiospermen, wat aangeeft dat het een relatief haalbare evolutionaire route is 19,20,21, en van verschillende taxa is aangetoond dat ze zich in een tussenstadium bevinden tussen het koolstofmetabolisme van C3 en C 4, aangeduid als C3-C 4 of C2, het vermogen hebben om CO2 te concentreren en opnieuw op te nemen 22,23,24,25.
VeelC3-planten zijn gewassen met een hoog economisch belang, en het genetisch manipuleren vanC3-gewassen, zoals rijst, om hun klimaatbestendigheid te verbeteren en de opbrengst veilig te stellen, is de afgelopen decennia een onderwerp van interesse geweest26,27. De technische inspanningen vragen echter om een gedetailleerd begrip van de gespecialiseerde anatomie van C4 en hoe deze de fotosynthese regelt 2,28.
Het vaststellen van de anatomie van C4 Kranz is een voorwaarde voor het bereiken van het ambitieuze doel om C 4-fotosynthese in C3-gewassen te integreren25. Het huidige begrip van de regulatie van de anatomie van Kranz en methoden voor het snel screenen van de belangrijkste anatomische kenmerken is echter beperkt, waardoor het moeilijk is om hybride soorten te identificeren. Eerdere studies hebben aangetoond dat de belangrijkste eigenschappen die de fotosynthese-efficiëntie in C3- en C4-planten reguleren, de afstand tussen de aders, de diameter van het bundelmantelcomplex en de grootte van de bundelschedecellenzijn 14,29. Deze eigenschappen kunnen gemakkelijk worden gescreend met behulp van secties uit de vrije hand en kwantitatief worden geanalyseerd met behulp van semi-dunne secties. Hier beschrijven we de methode voor het beoordelen van de eigenschappen dieC3- enC4-anatomische differentiatiediagnostiek mogelijk maken door middel van kruis- en lichtmicroscopie uit de vrije hand, namelijk het gebied van de bundelmantel, de interveneuze afstand en de aderfrequentie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO42H2O) pure</td>
			<td>PENTA, CZ</td>
			<td>10028-24-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Film, 7.8 mil Thick, 8 x 12.5, (203 x 318mm)</td>
			<td>ACLAR, US</td>
			<td>10501-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, abs. 100% a.r.</td>
			<td>Chem-Lab NV, BE</td>
			<td>CL00.0505.1000</td>
			<td>Danger: Highly inflammable liquid and vapour.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Invitrogen FL Auto 2 Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Embedding PTFE Mold with Metal Frame, 16 cavities</td>
			<td>PELCO, US</td>
			<td>10501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial 2 ml</td>
			<td>VWR Life Science, US</td>
			<td>548-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 50% solution</td>
			<td>VWR Life Science, US</td>
			<td>23H2856331</td>
			<td>Danger: Fatal if inhaled. Toxic if swallowed. Causes severe skin burns and eye damage. May cause respiratory irritation. Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo diamond knife</td>
			<td>Diatome, US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA EM UC7</td>
			<td>Leica Vienna, AT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White resin hard grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, US</td>
			<td>14383</td>
			<td>Danger: Causes skin irritation. Causes severe eye irritation May cause respiratory irritation. May cause drowsiness or dizziness Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Normax, PT</td>
			<td>5470308A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E600 and Nikon DS0Fi1 5 MP</td>
			<td>Nikon Corporation, JP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide (OsO4)</td>
			<td>Agar Scientific Ltd, GB</td>
			<td>R1019</td>
			<td>Danger: Fatal if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Causes severe skin burns and eye damage Wear double protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette and pipette tips</td>
			<td>Thermo Scientific, FI</td>
			<td>KJ16047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 . 2H2O) pure</td>
			<td>PENTA, CZ</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 ml</td>
			<td>Ecoject, DE</td>
			<td>20010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue, general purpose grade</td>
			<td>Fisher Scientific, GB</td>
			<td>2045836</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing structural traits in triticum aestivum and zea mays for c3 and c4 photosynthetic differentiation using free-hand and semi-thin sections

De verbeterde efficiëntie vanC4-fotosynthese , vergeleken met hetC3-mechanisme , komt voort uit het vermogen om CO2 te concentreren in bundelmantelcellen. De effectiviteit vanC4-fotosynthese en de efficiëntie van het intrinsieke watergebruik zijn direct gekoppeld aan het aandeel mesofyl- en bundelbladcellen, de grootte en dichtheid van bundelomhulsels, en de grootte, dichtheid en celwanddikte van bundelschedecellen. Snelle microscopische analyse van deze eigenschappen kan worden uitgevoerd op secties uit de vrije hand en halfdunne secties met behulp van conventionele lichtmicroscopie, wat waardevolle informatie oplevert over de fotosynthese-efficiëntie inC4-gewassen door middel van het identificeren en onderzoeken van specifieke celtypen. Bovendien worden fouten in de voorbereiding van halfdunne secties uit de vrije hand en semi-dunne secties getoond die van invloed zijn op anatomische metingen en celtypediagnoses, evenals hoe deze fouten kunnen worden vermeden. Deze microscopische benadering biedt een efficiënte manier om inzicht te krijgen in fotosynthetische acclimatisatie aan milieuvariatie en helpt bij het snel screenen van gewassen voor toekomstige klimaten.

Photosynthesis is a fundamental process where light energy is converted into chemical energy, serving as the cornerstone of terrestrial trophic networks. The majority of plants follow the C3 pathway of photosynthesis, where the primary photosynthetic product is the three-carbon compound glycerate 3-phosphate. C3 photosynthesis evolved over 2 billion years ago in the atmosphere abundant in CO2 and low in O21. The key photosynthetic enzyme ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco), which evolved under these conditions, is suboptimal for current low CO2 high O2 conditions as it competitively reacts with O2, initiating photorespiration2. Photorespiration is a wasteful pathway that consumes energy instead of producing it and releasing CO2 as a byproduct. Consequently, it is crucial to maintain high CO2 concentration around Rubisco in chloroplasts to prevent oxygenation3,4. Due to the inability of C3 plants to concentrate CO2, there is a significant CO2 drawdown from ambient air to chloroplasts, curbing photosynthesis and affecting plant growth and biomass production2,5,6.
In C3 plants, photosynthesis is limited by the entrance of CO2 through stomata, its diffusion through the mesophyll, and the biochemical activity of photosynthetic enzymes. The entry of CO2 is first limited by stomatal conductance, which is controlled by environmental conditions such as air temperature and humidity. Then CO2 diffuses through the leaf&#39;s internal gaseous and liquid phase to Rubisco7. In C3 plants, all stages of photosynthesis occur in the chloroplasts of mesophyll cells, and plants need to maintain a constant influx of CO2 from the atmosphere into chloroplasts. The dependence of CO2 availability in chloroplasts on stomatal openness, mesophyll architecture, and individual cell and chloroplast characteristics leaves plants susceptible to environmental constraints that eventually affect photosynthesis, like low water availability and high temperatures7,8,9,10, particularly highlighting their vulnerability to climate change conditions11.
Given the challenges posed by the inefficiencies of the C3 pathway, as well as limitations in maintaining optimal CO2 levels and susceptibility to environmental factors, in certain plants, another pathway, the C4 photosynthesis pathway, has evolved. Characteristically, C4 plants have two spatially separated biochemical pathways; the initial CO2 fixation occurs in mesophyll cells by phosphoenolpyruvate carboxylase, which has a higher affinity for CO2 than Rubisco and also lacks oxygenation activity. The formed C4 product is further transported to bundle sheath cells, where it is decarboxylated, and CO2 is again released and fixed by Rubisco (C3 photosynthesis)12,13,14. The greater affinity of PEP carboxylase to CO2 and thick cell walls of bundle sheath cells allows CO2 concentration in bundle sheath cells, and thus, C4 plants minimize the photorespiration by spatially segregating CO2 fixation and the Calvin cycle. The adoption of the C4 pathway showcases nature&#39;s adaptive response to environmental constraints, offering insights into potential strategies for improving crop productivity and resilience in changing climate conditions15.
The specialized anatomy of the leaf structure in C4 plants is characterized by veins surrounded by enlarged vascular bundle sheath cells containing chloroplasts and with a radial arrangement of mesophyll cells in an outer ring patterning around bundle sheath cells. The mesophyll cells are in close proximity to the bundle sheath cells, which enables a rapid and continuous transport of metabolites between the two cell types. This cell&#39;s arrangement is typical of C4 plants and is referred to as Kranz anatomy16. In C3 species, mesophyll cell specialization and disposition can vary, but bundle sheath cells are distinctly smaller and have a few chloroplasts or no chloroplasts at all. Specific Kranz anatomy allows concentrating CO2 in chloroplasts in bundle sheath cells where the C3-carboxylating enzyme Rubisco is located, effectively hindering photorespiration4, 17, 18. Despite its seemingly complex arrangement, these changes have occurred independently multiple times in the evolution of angiosperms, indicating that it is a relatively feasible evolutionary pathway19,20,21, and various taxa have been shown to be at an intermediate stage between C3 and C4 carbon metabolism, referred to as C3-C4 or C2, having abilities to concentrate and re-assimilate CO222,23,24,25.
Many C4 plants are crops with high economic importance, and genetically engineering C3 crops, like rice, to improve their climate resilience and secure the yield has been a topic of interest in the last decades26,27. However, the engineering efforts call for a detailed understanding of C4 specialized anatomy and how it controls photosynthesis2,28.
Establishing the C4 Kranz anatomy is a prerequisite to achieving the ambitious goal of engineering C4 photosynthesis into C3 crops25. However, the current understanding of the regulation of Kranz anatomy and methods for quickly screening its key anatomical traits is limited, making it difficult to identify hybrid species. Previous studies have shown that key traits regulating photosynthetic efficiency in C3 and C4 plants include the interveinal distance, the diameter of the bundle sheath complex, and the size of bundle sheath cells14,29. These traits can be easily screened using free-hand sections and quantitatively analyzed using semi-thin sections. Here, we describe the method of assessing the traits that allow for C3 and C4 anatomical differentiation diagnostics through free-hand cross and light microscopy, namely bundle sheath area, interveinal distance, and vein frequency.

Auteur in de schijnwerpers: innovatieve benaderingen voor het begrijpen van plantstructuur-functierelaties voor klimaatbestendige gewassen

Beoordeling van structurele kenmerken in Triticum aestivum en Zea mays voor C3 en C4 fotosynthetische differentiatie met behulp van vrije hand en halfdunne secties

Our research focuses on plant structure, function relationships. We aim to better understand the limitations to photosynthesis across plant functional types and how they can be improved for climate-resilient crops. New technology and software are expensive and often inaccessible, which requires a degree of trial and innovation to accomplish the same resolutions in imaging different plant functional types.The identification of anatomical structures that differentiate C3 and C4 leaves, particularly in as well as troubleshooting the preparative steps for microscopy.

Figuur 1A toont de juiste oriëntatie voor het doorsnijden van het blad voor zowel verse doorsnede als lichtmicroscopie. De methode voor het snijden van verse secties met behulp van een enkelzijdig scheermes en een tandwasvel is te zien in figuur 1B. De resulterende secties zijn weergegeven in figuur 1C.
Figuur 2 toont uit de vrije hand delen van representatieve bladeren van ...

Het beoordelen van de anatomische verschillen tussen C3 en C4 bladdoorsneden helpt de efficiëntie van fotosynthese te begrijpen. Dit artikel beschrijft de voorbereiding en het onderzoek van dwarsdoorsneden uit de vrije hand en halfdunne bladeren, samen met de kanttekeningen bij de voorbereiding voor de gewassoorten Triticum aestivum en Zea mays.

The enhanced efficiency of C4 photosynthesis, compared to the C3 mechanism, arises from its ability to concentrate CO2 in bundle sheath cells. The ...

assessing-structural-traits-triticum-aestivum-zea-mays-for-c3-c4

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Structural Traits in Triticum aestivum and Zea mays for C3 and C4 Photosynthetic Differentiation Using Free-hand and Semi-thin Sections

Beoordeling van structurele kenmerken in Triticum aestivum en Zea mays voor C₃ en C₄ fotosynthetische differentiatie met behulp van vrije hand en halfdunne secties

Abstract