Die Autoren erkennen das H2020-Programm der Europäischen Union an (Projekt GAIN4CROPS, GA Nr. 862087). Das Kompetenzzentrum AgroCropFuture Agrarökologie und neue Kulturpflanzen in zukünftigen Klimazonen wird vom estnischen Ministerium für Bildung und Forschung finanziert. Wir danken Professor Evelin Loit-Harro für die Bereitstellung von Samen von T. aestivum und Z. mays, Paula Palmet und Vaiko Vainola für ihre Unterstützung bei der Erstellung von Blattquerschnitten und João Paulo de Silva Souza für die Unterstützung bei der Analyse. Alle Bilder wurden von der Mikroskopie-Abteilung der Estnischen Universität für Biowissenschaften im Rahmen verschiedener Projekte gewonnen.

1. Bedingungen für das Pflanzenwachstum
<ol><li>Weizen (Triticum aestivum L. Var. Winterweizen, "Fredis") und Mais (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam") als repräsentative C3 bzw. C4 Pflanzen auswählen. Züchten Sie beide Pflanzenarten in einer umweltkontrollierten Wachstumskammer aus Samen.</li>
	<li>Halten Sie die relative Luftfeuchtigkeit bei 55 % und die Lufttemperatur bei 25 °C/18 °C (Tag/Nacht) mit einer Lichtperiode von 12 Stunden. Halten Sie...

Mikroskopische Analyse zur Verbesserung der photosynthetischen Effizienz in C4-Pflanzen

In diesem Artikel diskutieren wir sowohl die quantitativen als auch qualitativen Methoden zur Messung der Blattanatomie und Möglichkeiten, wie sie optimiert werden können. Darüber hinaus wird die Methodik auf repräsentative Kulturpflanzenarten angewendet, um zu bestimmen, welche anatomischen Merkmale für die Unterscheidung zwischenC3 - undC4-Querschnitten am nützlichsten sind. Das Verständnis dieser Merkmale ist von entscheidender Bedeutung, da Hybridarten, die alsC2-Photosynthese ...

Die Photosynthese ist ein grundlegender Prozess, bei dem Lichtenergie in chemische Energie umgewandelt wird und als Eckpfeiler der terrestrischen trophischen Netzwerke dient. Die meisten Pflanzen folgen demC3-Weg der Photosynthese, bei dem das primäre Photosyntheseprodukt die Drei-Kohlenstoff-Verbindung Glycerat 3-phosphat ist. Die C3-Photosynthese entwickelte sich vor über 2 Milliarden Jahren in der Atmosphäre, die reich an CO2 und arm an O21 ist. Das wichtige photosynthetische Enzym Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase (Rubisco), das sich unter diesen Bedingungen entwickelt hat, ist für diederzeitigen Bedingungen mit niedrigem CO2 -Gehalt suboptimal, da es kompetitiv mit O2 reagiert und die Photorespiration2 einleitet. Die Photorespiration ist ein verschwenderischer Weg, der Energie verbraucht, anstatt sie zu produzieren und CO2 als Nebenprodukt freizusetzen. Folglich ist es von entscheidender Bedeutung, eine hohe CO2 -Konzentration um Rubisco in den Chloroplasten aufrechtzuerhalten, um eine Sauerstoffversorgung zu verhindern 3,4. Aufgrund der Unfähigkeit von C3 -Pflanzen, CO2 zu konzentrieren, kommt es zu einem signifikanten CO2 -Abbau aus der Umgebungsluft zu den Chloroplasten, was die Photosynthese bremst und das Pflanzenwachstum und die Biomasseproduktion beeinträchtigt 2,5,6.
In C3-Pflanzen wird die Photosynthese durch den Eintritt von CO2 durch die Spaltöffnungen, seine Diffusion durch das Mesophyll und die biochemische Aktivität der photosynthetischen Enzyme begrenzt. Der Eintrag von CO2 wird zunächst durch die stomatäre Leitfähigkeit begrenzt, die durch Umgebungsbedingungen wie Lufttemperatur und Luftfeuchtigkeit gesteuert wird. Dann diffundiert CO2 durch die innere gasförmige und flüssige Phase des Blattes zu Rubisco7. In C3-Pflanzen finden alle Stadien der Photosynthese in den Chloroplasten der Mesophyllzellen statt, und die Pflanzen müssen einen konstanten Einstrom von CO2 aus der Atmosphäre in die Chloroplasten aufrechterhalten. Die Abhängigkeit der CO2 -Verfügbarkeit in Chloroplasten von der Offenheit der Stomata, der Mesophyllarchitektur und den individuellen Zell- und Chloroplasteneigenschaften macht Pflanzen anfällig für Umwelteinflüsse, die sich schließlich auf die Photosynthese auswirken, wie z. B. geringe Wasserverfügbarkeit und hohe Temperaturen 7,8,9,10, was insbesondere ihre Anfälligkeit für den Klimawandel unterstreicht11.
Angesichts der Herausforderungen, die sich aus der Ineffizienz desC3-Signalwegs ergeben, sowie der Einschränkungen bei der Aufrechterhaltung eines optimalen CO2 -Gehalts und der Anfälligkeit für Umweltfaktoren hat sich bei bestimmten Pflanzen ein anderer Weg, derC4-Photosyntheseweg, entwickelt. Charakteristisch für C4-Pflanzen sind zwei räumlich getrennte biochemische Wege; Die anfängliche CO2 -Fixierung erfolgt in Mesophyllzellen durch Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, die eine höhere Affinität zu CO2 als Rubisco aufweist und auch keine Oxygenierungsaktivität aufweist. Das gebildete C4 -Produkt wird weiter zu den Bündelscheidenzellen transportiert, wo es decarboxyliert wird, und CO2 wird durch Rubisco (C3 Photosynthese) wieder freigesetzt und fixiert12,13,14. Die größere Affinität der PEP-Carboxylase zu CO2 und die dicken Zellwände der Bündelscheidenzellen ermöglichen eine CO2 -Konzentration in den Bündelscheidenzellen, und somit minimieren C4 -Pflanzen die Photorespiration durch räumliche Segregation der CO2 -Fixierung und des Calvin-Zyklus. Die Einführung des C 4-Signalwegs zeigt die adaptive Reaktion der Natur auf Umwelteinflüsse und bietet Einblicke in mögliche Strategien zur Verbesserung der Produktivität und Widerstandsfähigkeit von Nutzpflanzen bei sich ändernden Klimabedingungen15.
Die spezialisierte Anatomie der Blattstruktur bei C4-Pflanzen ist gekennzeichnet durch Adern, die von vergrößerten Gefäßbündelscheidenzellen umgeben sind, die Chloroplasten enthalten, und durch eine radiale Anordnung von Mesophyllzellen in einem äußeren Ring, der sich um die Bündelscheidenzellen herum bildet. Die Mesophyllzellen befinden sich in unmittelbarer Nähe zu den Bündelscheidenzellen, was einen schnellen und kontinuierlichen Transport von Metaboliten zwischen den beiden Zelltypen ermöglicht. Die Anordnung dieser Zelle ist typisch für C4-Pflanzen und wird als Kranz-Anatomie16 bezeichnet. Bei C 3-Spezies kann die Spezialisierung und Disposition der Mesophyllzellen variieren, aber die Bündelscheidenzellen sind deutlich kleiner und haben wenige oder gar keine Chloroplasten. Die spezifische Anatomie von Kranz ermöglicht die Konzentration von CO2 in Chloroplasten in Bündelscheidenzellen, in denen sich das C 3-carboxylierende Enzym Rubisco befindet, wodurch die Photorespiration wirksam behindertwird 4,17,18. Trotz seiner scheinbar komplexen Anordnung sind diese Veränderungen in der Evolution der Angiospermen mehrfach unabhängig voneinander aufgetreten, was darauf hindeutet, dass es sich um einen relativ praktikablen Evolutionsweg handelt 19,20,21, und es wurde gezeigt, dass sich verschiedene Taxa in einem Zwischenstadium zwischen demC3- und dem C4-Kohlenstoffstoffwechsel befinden, der alsC3-C4 oderC2 bezeichnet wird. mit der Fähigkeit, CO2 2 22,23,24,25 zu konzentrieren und wieder aufzunehmen.
Viele C4-Pflanzen sind Pflanzen mit hoher wirtschaftlicher Bedeutung, und die gentechnische Veränderung von C3-Pflanzen, wie z. B. Reis, zur Verbesserung ihrer Klimaresilienz und zur Sicherung des Ertrags war in den letzten Jahrzehnten ein Thema von Interesse26,27. Die technischen Bemühungen erfordern jedoch ein detailliertes Verständnis derC4-spezialisierten Anatomie und wie sie die Photosynthese steuert 2,28.
Die Etablierung der C4 Kranz-Anatomie ist eine Voraussetzung, um das ehrgeizige Ziel zu erreichen, die C4-Photosynthese in C3-Pflanzen zu entwickeln25. Das derzeitige Verständnis der Regulation der Kranz-Anatomie und der Methoden zum schnellen Screening ihrer wichtigsten anatomischen Merkmale ist jedoch begrenzt, was die Identifizierung von Hybridarten erschwert. Frühere Studien haben gezeigt, dass zu den wichtigsten Merkmalen, die die photosynthetische Effizienz in C3- und C4-Pflanzen regulieren, der Venenabstand, der Durchmesser des Bündelscheidenkomplexes und die Größe der Bündelscheidenzellen gehören14,29. Diese Merkmale können leicht mit Freihandschnitten gescreent und mit halbdünnen Schnitten quantitativ analysiert werden. Im Folgenden wird die Methode zur Beurteilung der Merkmale beschrieben, die eine anatomische Differenzierungsdiagnostik von C3 undC 4 mittels Freihandkreuz- und Lichtmikroskopie ermöglichen, nämlich der Fläche der Bündelscheide, des intervenalen Abstands und der Venenfrequenz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO42H2O) pure</td>
			<td>PENTA, CZ</td>
			<td>10028-24-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Film, 7.8 mil Thick, 8 x 12.5, (203 x 318mm)</td>
			<td>ACLAR, US</td>
			<td>10501-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, abs. 100% a.r.</td>
			<td>Chem-Lab NV, BE</td>
			<td>CL00.0505.1000</td>
			<td>Danger: Highly inflammable liquid and vapour.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Invitrogen FL Auto 2 Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Embedding PTFE Mold with Metal Frame, 16 cavities</td>
			<td>PELCO, US</td>
			<td>10501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial 2 ml</td>
			<td>VWR Life Science, US</td>
			<td>548-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 50% solution</td>
			<td>VWR Life Science, US</td>
			<td>23H2856331</td>
			<td>Danger: Fatal if inhaled. Toxic if swallowed. Causes severe skin burns and eye damage. May cause respiratory irritation. Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo diamond knife</td>
			<td>Diatome, US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA EM UC7</td>
			<td>Leica Vienna, AT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White resin hard grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, US</td>
			<td>14383</td>
			<td>Danger: Causes skin irritation. Causes severe eye irritation May cause respiratory irritation. May cause drowsiness or dizziness Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Normax, PT</td>
			<td>5470308A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E600 and Nikon DS0Fi1 5 MP</td>
			<td>Nikon Corporation, JP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide (OsO4)</td>
			<td>Agar Scientific Ltd, GB</td>
			<td>R1019</td>
			<td>Danger: Fatal if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Causes severe skin burns and eye damage Wear double protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette and pipette tips</td>
			<td>Thermo Scientific, FI</td>
			<td>KJ16047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 . 2H2O) pure</td>
			<td>PENTA, CZ</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 ml</td>
			<td>Ecoject, DE</td>
			<td>20010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue, general purpose grade</td>
			<td>Fisher Scientific, GB</td>
			<td>2045836</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing structural traits in triticum aestivum and zea mays for c3 and c4 photosynthetic differentiation using free-hand and semi-thin sections

Die erhöhte Effizienz derC4-Photosynthese im Vergleich zumC3-Mechanismus ergibt sich aus ihrer Fähigkeit, CO2 in Bündelscheidenzellen zu konzentrieren. Die Wirksamkeit der C4-Photosynthese und die intrinsische Wassernutzungseffizienz stehen in direktem Zusammenhang mit dem Anteil von Mesophyll- und Bündelblattzellen, der Größe und Dichte der Bündelscheiden sowie der Größe, Dichte und Zellwanddicke der Bündelscheidenzellen. Eine schnelle mikroskopische Analyse dieser Merkmale kann mit der konventionellen Lichtmikroskopie an Freihand- und Halbdünnschnitten durchgeführt werden, die durch die Identifizierung und Untersuchung spezifischer Zelltypen wertvolle Informationen über die photosynthetische Effizienz in C4-Pflanzen liefert. Darüber hinaus werden Fehler in der Freihand- und Halbschliffvorbereitung aufgezeigt, die sich auf anatomische Messungen und Zelltypdiagnosen auswirken, sowie wie diese Fehler vermieden werden können. Dieser mikroskopische Ansatz bietet ein effizientes Mittel, um Einblicke in die photosynthetische Akklimatisierung an Umweltschwankungen zu gewinnen und hilft bei der schnellen Abschirmung von Nutzpflanzen für zukünftige Klimazonen.

Photosynthesis is a fundamental process where light energy is converted into chemical energy, serving as the cornerstone of terrestrial trophic networks. The majority of plants follow the C3 pathway of photosynthesis, where the primary photosynthetic product is the three-carbon compound glycerate 3-phosphate. C3 photosynthesis evolved over 2 billion years ago in the atmosphere abundant in CO2 and low in O21. The key photosynthetic enzyme ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco), which evolved under these conditions, is suboptimal for current low CO2 high O2 conditions as it competitively reacts with O2, initiating photorespiration2. Photorespiration is a wasteful pathway that consumes energy instead of producing it and releasing CO2 as a byproduct. Consequently, it is crucial to maintain high CO2 concentration around Rubisco in chloroplasts to prevent oxygenation3,4. Due to the inability of C3 plants to concentrate CO2, there is a significant CO2 drawdown from ambient air to chloroplasts, curbing photosynthesis and affecting plant growth and biomass production2,5,6.
In C3 plants, photosynthesis is limited by the entrance of CO2 through stomata, its diffusion through the mesophyll, and the biochemical activity of photosynthetic enzymes. The entry of CO2 is first limited by stomatal conductance, which is controlled by environmental conditions such as air temperature and humidity. Then CO2 diffuses through the leaf&#39;s internal gaseous and liquid phase to Rubisco7. In C3 plants, all stages of photosynthesis occur in the chloroplasts of mesophyll cells, and plants need to maintain a constant influx of CO2 from the atmosphere into chloroplasts. The dependence of CO2 availability in chloroplasts on stomatal openness, mesophyll architecture, and individual cell and chloroplast characteristics leaves plants susceptible to environmental constraints that eventually affect photosynthesis, like low water availability and high temperatures7,8,9,10, particularly highlighting their vulnerability to climate change conditions11.
Given the challenges posed by the inefficiencies of the C3 pathway, as well as limitations in maintaining optimal CO2 levels and susceptibility to environmental factors, in certain plants, another pathway, the C4 photosynthesis pathway, has evolved. Characteristically, C4 plants have two spatially separated biochemical pathways; the initial CO2 fixation occurs in mesophyll cells by phosphoenolpyruvate carboxylase, which has a higher affinity for CO2 than Rubisco and also lacks oxygenation activity. The formed C4 product is further transported to bundle sheath cells, where it is decarboxylated, and CO2 is again released and fixed by Rubisco (C3 photosynthesis)12,13,14. The greater affinity of PEP carboxylase to CO2 and thick cell walls of bundle sheath cells allows CO2 concentration in bundle sheath cells, and thus, C4 plants minimize the photorespiration by spatially segregating CO2 fixation and the Calvin cycle. The adoption of the C4 pathway showcases nature&#39;s adaptive response to environmental constraints, offering insights into potential strategies for improving crop productivity and resilience in changing climate conditions15.
The specialized anatomy of the leaf structure in C4 plants is characterized by veins surrounded by enlarged vascular bundle sheath cells containing chloroplasts and with a radial arrangement of mesophyll cells in an outer ring patterning around bundle sheath cells. The mesophyll cells are in close proximity to the bundle sheath cells, which enables a rapid and continuous transport of metabolites between the two cell types. This cell&#39;s arrangement is typical of C4 plants and is referred to as Kranz anatomy16. In C3 species, mesophyll cell specialization and disposition can vary, but bundle sheath cells are distinctly smaller and have a few chloroplasts or no chloroplasts at all. Specific Kranz anatomy allows concentrating CO2 in chloroplasts in bundle sheath cells where the C3-carboxylating enzyme Rubisco is located, effectively hindering photorespiration4, 17, 18. Despite its seemingly complex arrangement, these changes have occurred independently multiple times in the evolution of angiosperms, indicating that it is a relatively feasible evolutionary pathway19,20,21, and various taxa have been shown to be at an intermediate stage between C3 and C4 carbon metabolism, referred to as C3-C4 or C2, having abilities to concentrate and re-assimilate CO222,23,24,25.
Many C4 plants are crops with high economic importance, and genetically engineering C3 crops, like rice, to improve their climate resilience and secure the yield has been a topic of interest in the last decades26,27. However, the engineering efforts call for a detailed understanding of C4 specialized anatomy and how it controls photosynthesis2,28.
Establishing the C4 Kranz anatomy is a prerequisite to achieving the ambitious goal of engineering C4 photosynthesis into C3 crops25. However, the current understanding of the regulation of Kranz anatomy and methods for quickly screening its key anatomical traits is limited, making it difficult to identify hybrid species. Previous studies have shown that key traits regulating photosynthetic efficiency in C3 and C4 plants include the interveinal distance, the diameter of the bundle sheath complex, and the size of bundle sheath cells14,29. These traits can be easily screened using free-hand sections and quantitatively analyzed using semi-thin sections. Here, we describe the method of assessing the traits that allow for C3 and C4 anatomical differentiation diagnostics through free-hand cross and light microscopy, namely bundle sheath area, interveinal distance, and vein frequency.

Autoren-Spotlight: Innovative Ansätze zum Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehungen von Pflanzen für klimaresiliente Nutzpflanzen

Bewertung der strukturellen Merkmale in Triticum aestivum und Zea mays für die photosynthetische Differenzierung von C3 und C4 mittels Freihand- und Halbdünnschliffen

Our research focuses on plant structure, function relationships. We aim to better understand the limitations to photosynthesis across plant functional types and how they can be improved for climate-resilient crops. New technology and software are expensive and often inaccessible, which requires a degree of trial and innovation to accomplish the same resolutions in imaging different plant functional types.The identification of anatomical structures that differentiate C3 and C4 leaves, particularly in as well as troubleshooting the preparative steps for microscopy.

Abbildung 1A zeigt die korrekte Ausrichtung für das Schneiden des Blattes sowohl für das frische Schneiden als auch für die Lichtmikroskopie. Das Verfahren zum Schneiden frischer Schnitte mit einem einseitigen Rasiermesser und einem Zahnwachsblatt ist in Abbildung 1B zu sehen. Die daraus resultierenden Schnitte sind in Abbildung 1C dargestellt.
Abbildung 2 zeigt Freihandsc...

Die Beurteilung der anatomischen Unterschiede zwischen den Blattquerschnitten von C3 undC 4 hilft dabei, die Effizienz der Photosynthese zu verstehen. In dieser Arbeit werden die freihändige und halbdünne Blattquerschnittspräparation und -untersuchung sowie die Vorbehalte bei der Präparation für die Kulturarten Triticum aestivum und Zea mays beschrieben.

The enhanced efficiency of C4 photosynthesis, compared to the C3 mechanism, arises from its ability to concentrate CO2 in bundle sheath cells. The ...

assessing-structural-traits-triticum-aestivum-zea-mays-for-c3-c4

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Structural Traits in Triticum aestivum and Zea mays for C3 and C4 Photosynthetic Differentiation Using Free-hand and Semi-thin Sections

Bewertung der strukturellen Merkmale in Triticum aestivum und Zea mays für die photosynthetische Differenzierung von C₃ und C₄ mittels Freihand- und Halbdünnschliffen

Abstract