Os autores reconhecem o Programa H2020 da União Europeia (projeto GAIN4CROPS, GA no. 862087). O Centro de Excelência AgroCropFuture Agroecology e novas culturas em climas futuros é financiado pelo Ministério da Educação e Pesquisa da Estônia. Agradecemos à professora Evelin Loit-Harro pelo fornecimento de sementes de T. aestivum e Z. mays, a Paula Palmet e Vaiko Vainola pelo auxílio na preparação dos cortes transversais das folhas, e a João Paulo de Silva Souza pelo auxílio na análise. Todas as imagens foram obtidas da unidade de microscopia da Universidade de Ciências da Vida da Estônia em vários projetos.

1. Condições de crescimento das plantas
<ol><li>Selecione trigo (Triticum aestivum L. Var. Trigo de inverno, "Fredis") e milho (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam") como plantas representativas C3 e C4 , respectivamente. Cultive ambas as espécies de plantas em uma câmara de crescimento controlada pelo ambiente a partir de sementes.</li>
	<li>Mantenha a umidade relativa em 55% com a temperatura do ar em 25 °C/18 °C (dia/noite) com um período de luz...

Análise microscópica para aumentar a eficiência fotossintética em culturas C4

Neste artigo, discutimos os métodos quantitativos e qualitativos de medição da anatomia foliar e as maneiras pelas quais eles podem ser otimizados. Além disso, a metodologia é aplicada a espécies de culturas representativas para determinar quais características anatômicas são mais úteis na distinção entre as seções transversais C3 e C4 . Compreender essas características é essencial, pois as espécies híbridas, denominadas fotossíntese C2 , estão se tornando uma via de ...

A fotossíntese é um processo fundamental onde a energia luminosa é convertida em energia química, servindo como pedra angular das redes tróficas terrestres. A maioria das plantas segue a via C3 da fotossíntese, onde o principal produto fotossintético é o composto de três carbonos glicerato 3-fosfato. A fotossíntese C3 evoluiu há mais de 2 bilhões de anos na atmosfera abundante em CO2 e baixa em O21. A principal enzima fotossintética ribulose 1,5 bifosfato carboxilase / oxigenase (Rubisco), que evoluiu nessas condições, é subótima para as atuais condições de baixo CO2 alto O2, pois reage competitivamente com O2, iniciando a fotorrespiração2. A fotorrespiração é uma via de desperdício que consome energia em vez de produzi-la e liberar CO2 como subproduto. Consequentemente, é crucial manter alta concentração de CO2 ao redor da Rubisco nos cloroplastos para evitar a oxigenação 3,4. Devido à incapacidade das plantas de C3 de concentrar CO2, há uma redução significativa de CO2 do ar ambiente para os cloroplastos, restringindo a fotossíntese e afetando o crescimento das plantas e a produção de biomassa 2,5,6.
Em plantas C3, a fotossíntese é limitada pela entrada de CO2 através dos estômatos, sua difusão através do mesofilo e a atividade bioquímica das enzimas fotossintéticas. A entrada de CO2 é inicialmente limitada pela condutância estomática, que é controlada por condições ambientais, como temperatura e umidade do ar. Em seguida, o CO2 se difunde através da fase gasosa e líquida interna da folha para Rubisco7. Nas plantas C3, todos os estágios da fotossíntese ocorrem nos cloroplastos das células do mesofilo, e as plantas precisam manter um influxo constante de CO2 da atmosfera para os cloroplastos. A dependência da disponibilidade de CO2 nos cloroplastos na abertura estomática, na arquitetura do mesofilo e nas características individuais das células e do cloroplasto deixa as plantas suscetíveis a restrições ambientais que eventualmente afetam a fotossíntese, como baixa disponibilidade de água e altas temperaturas 7,8,9,10, destacando particularmente sua vulnerabilidade às condições de mudança climática11.
Dados os desafios impostos pelas ineficiências da via C3, bem como as limitações na manutenção de níveis ideais de CO2 e suscetibilidade a fatores ambientais, em certas plantas, outra via, a via de fotossíntese C4, evoluiu. Caracteristicamente, as plantas C4 têm duas vias bioquímicas separadas espacialmente; a fixação inicial do CO2 ocorre nas células do mesofilo pela fosfoenolpiruvato carboxilase, que tem maior afinidade pelo CO2 do que a Rubisco e também não possui atividade de oxigenação. O produto C4 formado é posteriormente transportado para as células da bainha do feixe, onde é descarboxilado, e o CO2 é novamente liberado e fixado por Rubisco (fotossíntese C3) 12 , 13 , 14 . A maior afinidade da PEP carboxilase com o CO2 e as paredes celulares espessas das células da bainha do feixe permite a concentração de CO2 nas células da bainha do feixe e, portanto, as plantas de C4 minimizam a fotorrespiração segregando espacialmente a fixação de CO2 e o ciclo de Calvin. A adoção do caminho C4 mostra a resposta adaptativa da natureza às restrições ambientais, oferecendo insights sobre estratégias potenciais para melhorar a produtividade e a resiliência das culturas em mudanças nas condições climáticas15.
A anatomia especializada da estrutura foliar em plantas C4 é caracterizada por nervuras cercadas por células da bainha do feixe vascular aumentadas contendo cloroplastos e com um arranjo radial de células do mesofilo em um padrão de anel externo ao redor das células da bainha do feixe. As células do mesofilo estão próximas às células da bainha do feixe, o que permite um transporte rápido e contínuo de metabólitos entre os dois tipos de células. O arranjo dessa célula é típico das plantas C4 e é conhecido como anatomia de Kranz16. Nas espécies C3, a especialização e a disposição das células do mesofilo podem variar, mas as células da bainha do feixe são distintamente menores e têm alguns cloroplastos ou nenhum cloroplasto. A anatomia específica de Kranz permite concentrar o CO2 nos cloroplastos nas células da bainha do feixe onde se localiza a enzima carboxilante C3 Rubisco, dificultando efetivamente a fotorrespiração 4,17,18. Apesar de seu arranjo aparentemente complexo, essas mudanças ocorreram independentemente várias vezes na evolução das angiospermas, indicando que é uma via evolutiva relativamente viável 19,20,21, e vários táxons demonstraram estar em um estágio intermediário entre o metabolismo do carbono C 3 e C4, referido como C3-C 4 ou C 2, ter habilidades para se concentrar e reassimilar CO2 22,23,24,25.
Muitas plantas C4 são culturas com alta importância econômica, e a engenharia genética de culturas C3, como o arroz, para melhorar sua resiliência climática e garantir o rendimento tem sido um tópico de interesse nas últimas décadas26,27. No entanto, os esforços de engenharia exigem uma compreensão detalhada da anatomia especializada em C4 e como ela controla a fotossíntese 2,28.
Estabelecer a anatomia de C4 Kranz é um pré-requisito para atingir a ambiciosa meta de projetar a fotossíntese de C4 em culturas C3 25. No entanto, a compreensão atual da regulação da anatomia de Kranz e dos métodos para rastrear rapidamente suas principais características anatômicas é limitada, dificultando a identificação de espécies híbridas. Estudos anteriores mostraram que as principais características que regulam a eficiência fotossintética em plantas C3 e C4 incluem a distância internerval, o diâmetro do complexo da bainha do feixe e o tamanho das células da bainha do feixe14,29. Essas características podem ser facilmente rastreadas usando seções à mão livre e analisadas quantitativamente usando seções semifinas. Aqui, descrevemos o método de avaliação das características que permitem o diagnóstico de diferenciação anatômica C3 e C4 por meio de microscopia cruzada e óptica à mão livre, ou seja, área da bainha do feixe, distância internerval e frequência da veia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO42H2O) pure</td>
			<td>PENTA, CZ</td>
			<td>10028-24-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Film, 7.8 mil Thick, 8 x 12.5, (203 x 318mm)</td>
			<td>ACLAR, US</td>
			<td>10501-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, abs. 100% a.r.</td>
			<td>Chem-Lab NV, BE</td>
			<td>CL00.0505.1000</td>
			<td>Danger: Highly inflammable liquid and vapour.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Invitrogen FL Auto 2 Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Embedding PTFE Mold with Metal Frame, 16 cavities</td>
			<td>PELCO, US</td>
			<td>10501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial 2 ml</td>
			<td>VWR Life Science, US</td>
			<td>548-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 50% solution</td>
			<td>VWR Life Science, US</td>
			<td>23H2856331</td>
			<td>Danger: Fatal if inhaled. Toxic if swallowed. Causes severe skin burns and eye damage. May cause respiratory irritation. Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo diamond knife</td>
			<td>Diatome, US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA EM UC7</td>
			<td>Leica Vienna, AT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White resin hard grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, US</td>
			<td>14383</td>
			<td>Danger: Causes skin irritation. Causes severe eye irritation May cause respiratory irritation. May cause drowsiness or dizziness Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Normax, PT</td>
			<td>5470308A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E600 and Nikon DS0Fi1 5 MP</td>
			<td>Nikon Corporation, JP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide (OsO4)</td>
			<td>Agar Scientific Ltd, GB</td>
			<td>R1019</td>
			<td>Danger: Fatal if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Causes severe skin burns and eye damage Wear double protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette and pipette tips</td>
			<td>Thermo Scientific, FI</td>
			<td>KJ16047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 . 2H2O) pure</td>
			<td>PENTA, CZ</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 ml</td>
			<td>Ecoject, DE</td>
			<td>20010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue, general purpose grade</td>
			<td>Fisher Scientific, GB</td>
			<td>2045836</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing structural traits in triticum aestivum and zea mays for c3 and c4 photosynthetic differentiation using free-hand and semi-thin sections

A eficiência aprimorada da fotossíntese C4 , em comparação com o mecanismo C3 , surge de sua capacidade de concentrar CO2 em células da bainha do feixe. A eficácia da fotossíntese C4 e a eficiência intrínseca do uso da água estão diretamente ligadas à participação do mesofilo e das células foliares do feixe, tamanho e densidade das bainhas do feixe e tamanho, densidade e espessura da parede celular das células da bainha do feixe. A análise microscópica rápida dessas características pode ser realizada em seções à mão livre e semifinas usando microscopia de luz convencional, fornecendo informações valiosas sobre a eficiência fotossintética em culturas C4 por meio da identificação e exame de tipos específicos de células. Além disso, são mostrados erros no preparo à mão livre e semifina que afetam as medidas anatômicas e os diagnósticos do tipo de célula, bem como a forma de evitar esses erros. Essa abordagem microscópica oferece um meio eficiente de coletar insights sobre a aclimatação fotossintética à variação ambiental e auxilia na triagem rápida de culturas para climas futuros.

Photosynthesis is a fundamental process where light energy is converted into chemical energy, serving as the cornerstone of terrestrial trophic networks. The majority of plants follow the C3 pathway of photosynthesis, where the primary photosynthetic product is the three-carbon compound glycerate 3-phosphate. C3 photosynthesis evolved over 2 billion years ago in the atmosphere abundant in CO2 and low in O21. The key photosynthetic enzyme ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco), which evolved under these conditions, is suboptimal for current low CO2 high O2 conditions as it competitively reacts with O2, initiating photorespiration2. Photorespiration is a wasteful pathway that consumes energy instead of producing it and releasing CO2 as a byproduct. Consequently, it is crucial to maintain high CO2 concentration around Rubisco in chloroplasts to prevent oxygenation3,4. Due to the inability of C3 plants to concentrate CO2, there is a significant CO2 drawdown from ambient air to chloroplasts, curbing photosynthesis and affecting plant growth and biomass production2,5,6.
In C3 plants, photosynthesis is limited by the entrance of CO2 through stomata, its diffusion through the mesophyll, and the biochemical activity of photosynthetic enzymes. The entry of CO2 is first limited by stomatal conductance, which is controlled by environmental conditions such as air temperature and humidity. Then CO2 diffuses through the leaf&#39;s internal gaseous and liquid phase to Rubisco7. In C3 plants, all stages of photosynthesis occur in the chloroplasts of mesophyll cells, and plants need to maintain a constant influx of CO2 from the atmosphere into chloroplasts. The dependence of CO2 availability in chloroplasts on stomatal openness, mesophyll architecture, and individual cell and chloroplast characteristics leaves plants susceptible to environmental constraints that eventually affect photosynthesis, like low water availability and high temperatures7,8,9,10, particularly highlighting their vulnerability to climate change conditions11.
Given the challenges posed by the inefficiencies of the C3 pathway, as well as limitations in maintaining optimal CO2 levels and susceptibility to environmental factors, in certain plants, another pathway, the C4 photosynthesis pathway, has evolved. Characteristically, C4 plants have two spatially separated biochemical pathways; the initial CO2 fixation occurs in mesophyll cells by phosphoenolpyruvate carboxylase, which has a higher affinity for CO2 than Rubisco and also lacks oxygenation activity. The formed C4 product is further transported to bundle sheath cells, where it is decarboxylated, and CO2 is again released and fixed by Rubisco (C3 photosynthesis)12,13,14. The greater affinity of PEP carboxylase to CO2 and thick cell walls of bundle sheath cells allows CO2 concentration in bundle sheath cells, and thus, C4 plants minimize the photorespiration by spatially segregating CO2 fixation and the Calvin cycle. The adoption of the C4 pathway showcases nature&#39;s adaptive response to environmental constraints, offering insights into potential strategies for improving crop productivity and resilience in changing climate conditions15.
The specialized anatomy of the leaf structure in C4 plants is characterized by veins surrounded by enlarged vascular bundle sheath cells containing chloroplasts and with a radial arrangement of mesophyll cells in an outer ring patterning around bundle sheath cells. The mesophyll cells are in close proximity to the bundle sheath cells, which enables a rapid and continuous transport of metabolites between the two cell types. This cell&#39;s arrangement is typical of C4 plants and is referred to as Kranz anatomy16. In C3 species, mesophyll cell specialization and disposition can vary, but bundle sheath cells are distinctly smaller and have a few chloroplasts or no chloroplasts at all. Specific Kranz anatomy allows concentrating CO2 in chloroplasts in bundle sheath cells where the C3-carboxylating enzyme Rubisco is located, effectively hindering photorespiration4, 17, 18. Despite its seemingly complex arrangement, these changes have occurred independently multiple times in the evolution of angiosperms, indicating that it is a relatively feasible evolutionary pathway19,20,21, and various taxa have been shown to be at an intermediate stage between C3 and C4 carbon metabolism, referred to as C3-C4 or C2, having abilities to concentrate and re-assimilate CO222,23,24,25.
Many C4 plants are crops with high economic importance, and genetically engineering C3 crops, like rice, to improve their climate resilience and secure the yield has been a topic of interest in the last decades26,27. However, the engineering efforts call for a detailed understanding of C4 specialized anatomy and how it controls photosynthesis2,28.
Establishing the C4 Kranz anatomy is a prerequisite to achieving the ambitious goal of engineering C4 photosynthesis into C3 crops25. However, the current understanding of the regulation of Kranz anatomy and methods for quickly screening its key anatomical traits is limited, making it difficult to identify hybrid species. Previous studies have shown that key traits regulating photosynthetic efficiency in C3 and C4 plants include the interveinal distance, the diameter of the bundle sheath complex, and the size of bundle sheath cells14,29. These traits can be easily screened using free-hand sections and quantitatively analyzed using semi-thin sections. Here, we describe the method of assessing the traits that allow for C3 and C4 anatomical differentiation diagnostics through free-hand cross and light microscopy, namely bundle sheath area, interveinal distance, and vein frequency.

Autor em destaque: abordagens inovadoras para entender as relações estrutura-função da planta para culturas resilientes ao clima

Avaliação de características estruturais em Triticum aestivum e Zea mays para diferenciação fotossintética C3 e C4 usando seções à mão livre e semifinas

Our research focuses on plant structure, function relationships. We aim to better understand the limitations to photosynthesis across plant functional types and how they can be improved for climate-resilient crops. New technology and software are expensive and often inaccessible, which requires a degree of trial and innovation to accomplish the same resolutions in imaging different plant functional types.The identification of anatomical structures that differentiate C3 and C4 leaves, particularly in as well as troubleshooting the preparative steps for microscopy.

A Figura 1A mostra a orientação correta para seccionar a folha para seccionamento fresco e microscopia de luz. O método para cortar seções frescas usando uma navalha de um lado e uma folha de cera dental pode ser visto na Figura 1B. As seções resultantes são mostradas na Figura 1C.
A Figura 2 mostra seções à mão livre de folhas representativas da planta C3</s...

Avaliar as diferenças anatômicas entre as seções transversais das folhas C3 e C4 ajuda a entender a eficiência da fotossíntese. Este artigo descreve a preparação e o exame de seções transversais de folhas à mão livre e semifinas, juntamente com as ressalvas na preparação para as espécies de culturas Triticum aestivum e Zea mays.

The enhanced efficiency of C4 photosynthesis, compared to the C3 mechanism, arises from its ability to concentrate CO2 in bundle sheath cells. The ...

assessing-structural-traits-triticum-aestivum-zea-mays-for-c3-c4

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Structural Traits in Triticum aestivum and Zea mays for C3 and C4 Photosynthetic Differentiation Using Free-hand and Semi-thin Sections

Avaliação de características estruturais em Triticum aestivum e Zea mays para diferenciação fotossintética C₃ e C₄ usando seções à mão livre e semifinas

Abstract