Los autores reconocen el Programa H2020 de la Unión Europea (proyecto GAIN4CROPS, GA nº 862087). El Centro de Excelencia AgroCropCropFuturo Agroecología y nuevos cultivos en climas futuros está financiado por el Ministerio de Educación e Investigación de Estonia. Deseamos agradecer a la profesora Evelin Loit-Harro por proporcionar semillas de T. aestivum y Z. mays, a Paula Palmet y Vaiko Vainola por su asistencia en la preparación de las secciones transversales de las hojas, y a João Paulo de Silva Souza por su asistencia con el análisis. Todas las imágenes se obtuvieron de la unidad de microscopía de la Universidad de Ciencias de la Vida de Estonia en el marco de varios proyectos.

1. Condiciones de crecimiento de las plantas
<ol><li>Seleccione el trigo (Triticum aestivum L. Var. Winter Wheat, "Fredis") y el maíz (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam") como plantas representativas C3 y C4 , respectivamente. Cultive ambas especies de plantas en una cámara de crecimiento de semillas controlada en un ambiente.</li>
	<li>Mantenga la humedad relativa al 55% con la temperatura del aire a 25 °C/18 °C (día/noche) con un período de luz ...

Análisis microscópico para mejorar la eficiencia fotosintética en cultivos C4

En este artículo, discutimos los métodos cuantitativos y cualitativos para medir la anatomía de las hojas y las formas en que se pueden optimizar. Además, la metodología se aplica a especies representativas de cultivos con el fin de determinar qué rasgos anatómicos son más útiles para distinguir entre las secciones transversales C3 y C4 . La comprensión de estos rasgos es esencial, ya que las especies híbridas, denominadas fotosíntesisC2 , se están convirtiendo en una vía de...

La fotosíntesis es un proceso fundamental en el que la energía luminosa se convierte en energía química, sirviendo como piedra angular de las redes tróficas terrestres. La mayoría de las plantas siguen la vía C3 de la fotosíntesis, donde el principal producto fotosintético es el compuesto de tres carbonos glicerato 3-fosfato. La fotosíntesis deC3 evolucionó hace más de 2.000 millones de años en una atmósfera abundante enCO2 y baja enO21. La enzima fotosintética clave, la ribulosa 1,5 bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (Rubisco), que evolucionó en estas condiciones, no es óptima para las condiciones actuales de bajo contenido deCO2 y alto contenido deO2, ya que reacciona competitivamente con elO2, iniciando la fotorrespiración2. La fotorrespiración es una vía de despilfarro que consume energía en lugar de producirla y liberarCO2 como subproducto. En consecuencia, es crucial mantener una alta concentración deCO2 alrededor de Rubisco en los cloroplastos para prevenir la oxigenación 3,4. Debido a la incapacidad de las plantasC3 para concentrar el CO2, se produce una importante reducción de CO2 del aire ambiente a los cloroplastos, lo que frena la fotosíntesis y afecta al crecimiento de las plantas y a la producción de biomasa 2,5,6.
En las plantasC3, la fotosíntesis está limitada por la entrada de CO2 a través de los estomas, su difusión a través del mesófilo y la actividad bioquímica de las enzimas fotosintéticas. La entrada de CO2 está limitada primero por la conductancia estomática, que está controlada por condiciones ambientales como la temperatura y la humedad del aire. Luego, el CO2 se difunde a través de la fase gaseosa y líquida interna de la hoja a Rubisco7. En las plantasC3, todas las etapas de la fotosíntesis ocurren en los cloroplastos de las células mesófilas, y las plantas necesitan mantener una afluencia constante de CO2 de la atmósfera a los cloroplastos. La dependencia de la disponibilidad deCO2 en los cloroplastos de la apertura estomática, la arquitectura mesófila y las características individuales de las células y los cloroplastos hace que las plantas sean susceptibles a las limitaciones ambientales que eventualmente afectan la fotosíntesis, como la baja disponibilidad de agua y las altas temperaturas 7,8,9,10, destacando particularmente su vulnerabilidad a las condiciones del cambio climático11.
Dados los desafíos planteados por las ineficiencias de la víaC3, así como las limitaciones para mantener niveles óptimos de CO2 y susceptibilidad a factores ambientales, en ciertas plantas, ha evolucionado otra vía, la vía de fotosíntesisC4. Característicamente, las plantasC4 tienen dos vías bioquímicas separadas espacialmente; la fijación inicial de CO2 se produce en las células del mesófilo por la fosfoenolpiruvato carboxilasa, que tiene una mayor afinidad por el CO2 que Rubisco y también carece de actividad de oxigenación. El productoC4 formado se transporta posteriormente a las células de la vaina del haz, donde se descarboxila, y el CO2 es nuevamente liberado y fijado por Rubisco (fotosíntesis de C3)12,13,14. La mayor afinidad de la PEP carboxilasa al CO2 y a las paredes celulares gruesas de las células de la vaina del haz permite la concentración de CO2 en las células de la vaina del haz y, por lo tanto, las plantas deC4 minimizan la fotorrespiración al segregar espacialmente la fijación de CO2 y el ciclo de Calvin. La adopción de la vía C4 muestra la respuesta adaptativa de la naturaleza a las limitaciones ambientales, ofreciendo información sobre posibles estrategias para mejorar la productividad y la resiliencia de los cultivos en condiciones climáticas cambiantes15.
La anatomía especializada de la estructura de la hoja en las plantasC4 se caracteriza por venas rodeadas de células de la vaina del haz vascular agrandadas que contienen cloroplastos y con una disposición radial de las células del mesófilo en un patrón de anillo exterior alrededor de las células de la vaina del haz. Las células mesófilas están muy cerca de las células de la vaina del haz, lo que permite un transporte rápido y continuo de metabolitos entre los dos tipos de células. La disposición de esta célula es típica de las plantas C4 y se conoce como anatomía de Kranz16. En las especiesC3, la especialización y disposición de las células mesófilas pueden variar, pero las células de la vaina del haz son claramente más pequeñas y tienen unos pocos cloroplastos o ningún cloroplasto. La anatomía específica de Kranz permite concentrar el CO2 en los cloroplastos de las células de la vaina donde se encuentra la enzima carboxilanteC3 Rubisco, dificultando eficazmente la fotorrespiración 4,17,18. A pesar de su disposición aparentemente compleja, estos cambios han ocurrido de forma independiente múltiples veces en la evolución de las angiospermas, lo que indica que es una vía evolutiva relativamente factible 19,20,21, y se ha demostrado que varios taxones se encuentran en una etapa intermedia entre el metabolismo del carbono C3 y C 4, denominados C3-C 4 o C2, tener habilidades para concentrarse y reasimilar CO2 22,23,24,25.
Muchas plantasC4 son cultivos de gran importancia económica, y la ingeniería genética de cultivosC3, como el arroz, para mejorar su resiliencia climática y asegurar el rendimiento ha sido un tema de interés en las últimas décadas26,27. Sin embargo, los esfuerzos de ingeniería requieren una comprensión detallada de la anatomía especializada deC4 y cómo controla la fotosíntesis 2,28.
El establecimiento de la anatomía de C4 Kranz es un requisito previo para lograr el ambicioso objetivo de diseñar la fotosíntesis de C4 en cultivos de C3 25. Sin embargo, la comprensión actual de la regulación de la anatomía del Kranz y los métodos para detectar rápidamente sus rasgos anatómicos clave es limitada, lo que dificulta la identificación de especies híbridas. Estudios previos han demostrado que los rasgos clave que regulan la eficiencia fotosintética en las plantas C3 y C4 incluyen la distancia intervenal, el diámetro del complejo de la vaina del haz y el tamaño de las células de la vainadel haz 14,29. Estos rasgos pueden filtrarse fácilmente utilizando secciones a mano alzada y analizarse cuantitativamente utilizando secciones semifinas. Aquí, describimos el método de evaluación de los rasgos que permiten el diagnóstico de la diferenciación anatómica de C3 y C4 a través de microscopía cruzada y óptica a mano alzada, a saber, el área de la vaina del haz, la distancia intervenal y la frecuencia de las venas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO42H2O) pure</td>
			<td>PENTA, CZ</td>
			<td>10028-24-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Film, 7.8 mil Thick, 8 x 12.5, (203 x 318mm)</td>
			<td>ACLAR, US</td>
			<td>10501-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, abs. 100% a.r.</td>
			<td>Chem-Lab NV, BE</td>
			<td>CL00.0505.1000</td>
			<td>Danger: Highly inflammable liquid and vapour.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Invitrogen FL Auto 2 Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Embedding PTFE Mold with Metal Frame, 16 cavities</td>
			<td>PELCO, US</td>
			<td>10501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial 2 ml</td>
			<td>VWR Life Science, US</td>
			<td>548-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 50% solution</td>
			<td>VWR Life Science, US</td>
			<td>23H2856331</td>
			<td>Danger: Fatal if inhaled. Toxic if swallowed. Causes severe skin burns and eye damage. May cause respiratory irritation. Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histo diamond knife</td>
			<td>Diatome, US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA EM UC7</td>
			<td>Leica Vienna, AT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White resin hard grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, US</td>
			<td>14383</td>
			<td>Danger: Causes skin irritation. Causes severe eye irritation May cause respiratory irritation. May cause drowsiness or dizziness Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Normax, PT</td>
			<td>5470308A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse E600 and Nikon DS0Fi1 5 MP</td>
			<td>Nikon Corporation, JP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide (OsO4)</td>
			<td>Agar Scientific Ltd, GB</td>
			<td>R1019</td>
			<td>Danger: Fatal if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Causes severe skin burns and eye damage Wear double protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette and pipette tips</td>
			<td>Thermo Scientific, FI</td>
			<td>KJ16047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 . 2H2O) pure</td>
			<td>PENTA, CZ</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 ml</td>
			<td>Ecoject, DE</td>
			<td>20010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue, general purpose grade</td>
			<td>Fisher Scientific, GB</td>
			<td>2045836</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing structural traits in triticum aestivum and zea mays for c3 and c4 photosynthetic differentiation using free-hand and semi-thin sections

La mayor eficiencia de la fotosíntesis deC4 , en comparación con el mecanismo deC3 , surge de su capacidad para concentrar CO2 en las células de la vaina del haz. La eficacia de la fotosíntesisC4 y la eficiencia intrínseca del uso del agua están directamente relacionadas con la proporción de células del mesófilo y de las hojas del haz, el tamaño y la densidad de las vainas del haz, y el tamaño, la densidad y el grosor de la pared celular de las células de la vaina del haz. El análisis microscópico rápido de estos rasgos se puede realizar en secciones a mano alzada y semidelgadas utilizando microscopía óptica convencional, proporcionando información valiosa sobre la eficiencia fotosintética en cultivos deC4 mediante la identificación y el examen de tipos celulares específicos. Además, se muestran los errores en la preparación de secciones a mano alzada y semifinas que afectan a las mediciones anatómicas y a los diagnósticos de tipos de células, así como la forma de evitar estos errores. Este enfoque microscópico ofrece un medio eficiente para recopilar información sobre la aclimatación fotosintética a la variación ambiental y ayuda en la detección rápida de cultivos para climas futuros.

Photosynthesis is a fundamental process where light energy is converted into chemical energy, serving as the cornerstone of terrestrial trophic networks. The majority of plants follow the C3 pathway of photosynthesis, where the primary photosynthetic product is the three-carbon compound glycerate 3-phosphate. C3 photosynthesis evolved over 2 billion years ago in the atmosphere abundant in CO2 and low in O21. The key photosynthetic enzyme ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco), which evolved under these conditions, is suboptimal for current low CO2 high O2 conditions as it competitively reacts with O2, initiating photorespiration2. Photorespiration is a wasteful pathway that consumes energy instead of producing it and releasing CO2 as a byproduct. Consequently, it is crucial to maintain high CO2 concentration around Rubisco in chloroplasts to prevent oxygenation3,4. Due to the inability of C3 plants to concentrate CO2, there is a significant CO2 drawdown from ambient air to chloroplasts, curbing photosynthesis and affecting plant growth and biomass production2,5,6.
In C3 plants, photosynthesis is limited by the entrance of CO2 through stomata, its diffusion through the mesophyll, and the biochemical activity of photosynthetic enzymes. The entry of CO2 is first limited by stomatal conductance, which is controlled by environmental conditions such as air temperature and humidity. Then CO2 diffuses through the leaf&#39;s internal gaseous and liquid phase to Rubisco7. In C3 plants, all stages of photosynthesis occur in the chloroplasts of mesophyll cells, and plants need to maintain a constant influx of CO2 from the atmosphere into chloroplasts. The dependence of CO2 availability in chloroplasts on stomatal openness, mesophyll architecture, and individual cell and chloroplast characteristics leaves plants susceptible to environmental constraints that eventually affect photosynthesis, like low water availability and high temperatures7,8,9,10, particularly highlighting their vulnerability to climate change conditions11.
Given the challenges posed by the inefficiencies of the C3 pathway, as well as limitations in maintaining optimal CO2 levels and susceptibility to environmental factors, in certain plants, another pathway, the C4 photosynthesis pathway, has evolved. Characteristically, C4 plants have two spatially separated biochemical pathways; the initial CO2 fixation occurs in mesophyll cells by phosphoenolpyruvate carboxylase, which has a higher affinity for CO2 than Rubisco and also lacks oxygenation activity. The formed C4 product is further transported to bundle sheath cells, where it is decarboxylated, and CO2 is again released and fixed by Rubisco (C3 photosynthesis)12,13,14. The greater affinity of PEP carboxylase to CO2 and thick cell walls of bundle sheath cells allows CO2 concentration in bundle sheath cells, and thus, C4 plants minimize the photorespiration by spatially segregating CO2 fixation and the Calvin cycle. The adoption of the C4 pathway showcases nature&#39;s adaptive response to environmental constraints, offering insights into potential strategies for improving crop productivity and resilience in changing climate conditions15.
The specialized anatomy of the leaf structure in C4 plants is characterized by veins surrounded by enlarged vascular bundle sheath cells containing chloroplasts and with a radial arrangement of mesophyll cells in an outer ring patterning around bundle sheath cells. The mesophyll cells are in close proximity to the bundle sheath cells, which enables a rapid and continuous transport of metabolites between the two cell types. This cell&#39;s arrangement is typical of C4 plants and is referred to as Kranz anatomy16. In C3 species, mesophyll cell specialization and disposition can vary, but bundle sheath cells are distinctly smaller and have a few chloroplasts or no chloroplasts at all. Specific Kranz anatomy allows concentrating CO2 in chloroplasts in bundle sheath cells where the C3-carboxylating enzyme Rubisco is located, effectively hindering photorespiration4, 17, 18. Despite its seemingly complex arrangement, these changes have occurred independently multiple times in the evolution of angiosperms, indicating that it is a relatively feasible evolutionary pathway19,20,21, and various taxa have been shown to be at an intermediate stage between C3 and C4 carbon metabolism, referred to as C3-C4 or C2, having abilities to concentrate and re-assimilate CO222,23,24,25.
Many C4 plants are crops with high economic importance, and genetically engineering C3 crops, like rice, to improve their climate resilience and secure the yield has been a topic of interest in the last decades26,27. However, the engineering efforts call for a detailed understanding of C4 specialized anatomy and how it controls photosynthesis2,28.
Establishing the C4 Kranz anatomy is a prerequisite to achieving the ambitious goal of engineering C4 photosynthesis into C3 crops25. However, the current understanding of the regulation of Kranz anatomy and methods for quickly screening its key anatomical traits is limited, making it difficult to identify hybrid species. Previous studies have shown that key traits regulating photosynthetic efficiency in C3 and C4 plants include the interveinal distance, the diameter of the bundle sheath complex, and the size of bundle sheath cells14,29. These traits can be easily screened using free-hand sections and quantitatively analyzed using semi-thin sections. Here, we describe the method of assessing the traits that allow for C3 and C4 anatomical differentiation diagnostics through free-hand cross and light microscopy, namely bundle sheath area, interveinal distance, and vein frequency.

Autor destacado: Enfoques innovadores para comprender las relaciones estructura-función de las plantas para cultivos resistentes al clima

Evaluación de rasgos estructurales en Triticum aestivum y Zea mays para la diferenciación fotosintética de C3 y C4 utilizando secciones a mano alzada y semidelgadas

Our research focuses on plant structure, function relationships. We aim to better understand the limitations to photosynthesis across plant functional types and how they can be improved for climate-resilient crops. New technology and software are expensive and often inaccessible, which requires a degree of trial and innovation to accomplish the same resolutions in imaging different plant functional types.The identification of anatomical structures that differentiate C3 and C4 leaves, particularly in as well as troubleshooting the preparative steps for microscopy.

La Figura 1A muestra la orientación correcta para seccionar la hoja tanto para el corte fresco como para la microscopía óptica. El método para cortar secciones frescas usando una navaja de afeitar de un solo lado y una hoja de cera dental se puede ver en la Figura 1B. Las secciones resultantes se muestran en la Figura 1C.
La Figura 2 muestra secciones a mano alzada de hoj...

La evaluación de las diferencias anatómicas entre las secciones transversales de las hojas C3 y C4 ayuda a comprender la eficiencia de la fotosíntesis. Este artículo describe la preparación y el examen de las secciones transversales de hojas semifinas y a mano alzada, junto con las advertencias en la preparación de las especies de cultivo Triticum aestivum y Zea mays.

The enhanced efficiency of C4 photosynthesis, compared to the C3 mechanism, arises from its ability to concentrate CO2 in bundle sheath cells. The ...

assessing-structural-traits-triticum-aestivum-zea-mays-for-c3-c4

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Structural Traits in Triticum aestivum and Zea mays for C3 and C4 Photosynthetic Differentiation Using Free-hand and Semi-thin Sections

Evaluación de rasgos estructurales en Triticum aestivum y Zea mays para la diferenciación fotosintética de C₃ y C₄ utilizando secciones a mano alzada y semidelgadas

Abstract