基于质外体提取的方法提高植物产生的重组蛋白纯度

Summary

从植物系统中纯化重组蛋白通常受到植物蛋白的挑战。本研究提供了一种从本氏烟草质外体中有效提取和纯化分泌型重组蛋白的方法。

Abstract

植物是一种新开发的真核表达系统，正在探索以产生治疗性蛋白质。从植物中纯化重组蛋白是生产过程中最关键的步骤之一。通常，蛋白质是从总可溶性蛋白 （TSP） 中纯化的，而各种细胞内蛋白质和细胞色素的存在对后续的蛋白质纯化步骤提出了挑战。此外，大多数治疗性蛋白质（如抗原和抗体）的分泌都是为了获得适当的糖基化，而未完全修饰的蛋白质的存在会导致抗原或抗体结构不一致。这项工作介绍了一种从植物质外体空间获得高度纯化重组蛋白的更有效方法。重组绿色荧光蛋白 （GFP） 经过工程改造，可分泌到 本氏烟草 的质外体中，然后使用渗透-离心法提取。然后通过镍亲和层析纯化提取的质外体中的 GFP-His。与来自 TSP 的传统方法相比，从质外体中纯化可产生高度纯化的重组蛋白。这是植物生产系统的一项重要技术改进。

Introduction

如今，各种植物生产的重组治疗性蛋白质正在研究中，包括抗体、疫苗、生物活性蛋白、酶和小多肽 1,2,3,4,5,6。由于其安全性、低成本和快速扩大生产的能力，植物正成为越来越多地用于生产治疗性蛋白质的平台 ^7,8。植物系统中的蛋白质表达和修饰以及蛋白质纯化是决定植物生物反应器生产率的关键因素 ^9,10。提高植物生产率和获得高纯度靶蛋白是植物基生产系统面临的核心挑战^11,12。

重组蛋白的亚细胞定位和修饰取决于在 N 端编码的特异性信号肽，该肽在基因表达过程中将蛋白质靶向其最终细胞器目的地。重组蛋白根据其独特特性被设计为定位于质外质体、内质网....

Protocol

1. 本氏烟草植物的制备

1. 将幼苗块放入托盘中，加入 1 升水并浸泡约 2 小时直至完全饱和。
2. 将 野生型本氏烟草 种子均匀撒在幼苗块上，盖上盖子，发芽 1 周。在光周期为 18 小时、24°C、相对湿度为 45% 的温室中种植 本氏猪笼 草，每 2 周施肥一次。
3. 种子发芽后，用镊子轻轻去除幼苗，注意不要损坏其根部。在新托盘?.......

Discussion

近年来，使用植物生产治疗性蛋白质迅速扩大 ^1,2,3,4,5,6。蛋白质编码基因被克隆到表达载体中，并通过农杆菌渗透递送到植物组织中。植物细胞生产后，蛋白质被纯化用于下游应用。通常，重组蛋白是从 TSP 提取物中纯化的。然而，提取过程中植物?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mesh nylon fine mesh yarn	Guangzhou Huayu Trading limited company	hy-230724-2	For AWF protein extraction
50 ml centrifuge tubes	Vazyme	TCF00150	For centrifuge
ClonExpress II one step cloning kit	Vazyme	C112-02	For clone
FastDigest Sac1	NEB	R3156S	For clone
FastDigest XbaI	NEB	FD0685	For clone
ImageJ 1.5.0	/	/	For greyscale analysis
Large filter	Thermo Fisher	NEST	For filtering
Laser scanning confocal microscopy	Leica SP8		For subcellular localization
Ni sepharose excel	Cytiva	10339806	For protein purification
Precast protein plus gel	YEASEN	36246ES10	For SDS-PAGE
Small filter	Nalgene	1660045	For filtering
SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit	Thermo Fisher	34076	For western blotting
Triton X-100	SCR	30188928	To configure the extraction buffer
Type rotaryvang vacuum pump	Zhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company	2XZ-2	For vacuum infiltration
Vertical mixer	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited company	BE-1200	For mixing
β-mercaptoethanol	SIGMA	BCBK8223V	To configure the extraction buffer