שיטה מבוססת מיצוי אפופלסט לשיפור הטוהר של חלבון רקומביננטי המיוצר על ידי צמחים

Summary

טיהור חלבונים רקומביננטיים ממערכות צמחיות מאותגר בדרך כלל על ידי חלבונים צמחיים. עבודה זו מספקת שיטה למיצוי וטיהור יעיל של חלבון רקומביננטי מופרש מהאפופלסט של ניקוטיאנה בנתמיאנה.

Abstract

צמחים הם מערכת ביטוי אאוקריוטית חדשה שמתפתחת ונחקרת כדי לייצר חלבונים טיפוליים. טיהור חלבונים רקומביננטיים מצמחים הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר בתהליך הייצור. בדרך כלל, חלבונים טוהרו מחלבונים מסיסים כוללים (TSP), ונוכחותם של חלבונים תוך-תאיים וציטוכרומים שונים מציבה אתגרים לשלבי טיהור החלבונים הבאים. יתר על כן, רוב החלבונים הטיפוליים כמו אנטיגנים ונוגדנים מופרשים כדי להשיג גליקוזילציה נכונה, ונוכחות של חלבונים שהשתנו באופן לא מלא מובילה לאנטיגן או מבני נוגדנים לא עקביים. עבודה זו מציגה שיטה יעילה יותר להשגת חלבונים רקומביננטיים מטוהרים מאוד מהחלל האפופלסטי של הצמח. החלבון הפלואורסצנטי הירוק הרקומביננטי (GFP) מהונדס להיות מופרש לתוך אפופלסט של ניקוטיאנה בנטמיאנה ולאחר מכן מופק בשיטת חדירה-צנטריפוגה. ה-GFP-His מהאפופלסט המופק מטוהר לאחר מכן על ידי כרומטוגרפיית זיקה לניקל. בניגוד לשיטות המסורתיות של TSP, טיהור מהאפופלסט מייצר חלבונים רקומביננטיים מטוהרים מאוד. מדובר בשיפור טכנולוגי חשוב למערכות הייצור במפעלים.

Introduction

כיום, חלבונים טיפוליים רקומביננטיים שונים המיוצרים על ידי צמחים נחקרים, כולל נוגדנים, חיסונים, חלבונים ביו-אקטיביים, אנזימים ופוליפפטידים קטנים 1,2,3,4,5,6. צמחים הופכים לפלטפורמה מנוצלת יותר ויותר לייצור חלבונים טיפוליים בשל בטיחותם, עלותם הנמוכה ויכולתם להגדיל במהירות את הייצור ^7,8. ביטוי ושינוי חלבונים במערכות צמחיות, יחד עם טיהור חלבונים, הם גורמים קריטיים הקובעים את התפוקה של ביוריאקטורים צמחיים

Protocol

1. הכנת צמחי N. benthamiana

1. מניחים את קוביות השתיל במגש, מוסיפים ליטר מים ומשרים כשעתיים עד לרוויה מלאה.
2. מפזרים באופן שווה זרעי בר מסוג N. benthamiana על אבני השתיל, מכסים במכסה ונובטים במשך שבוע אחד. לגדל N. benthamiana בחממה עם 18 שעות photoperiod, 24 ° C, 45% לחות יחס.......

Discussion

השימוש בצמחים לייצור חלבונים טיפוליים התרחב במהירות בשנים האחרונות 1,2,3,4,5,6. גנים מקודדי חלבונים משובטים לווקטורי ביטוי ומועברים לרקמות הצמח באמצעות חדירה חקלאית. לאחר הייצור על י?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mesh nylon fine mesh yarn	Guangzhou Huayu Trading limited company	hy-230724-2	For AWF protein extraction
50 ml centrifuge tubes	Vazyme	TCF00150	For centrifuge
ClonExpress II one step cloning kit	Vazyme	C112-02	For clone
FastDigest Sac1	NEB	R3156S	For clone
FastDigest XbaI	NEB	FD0685	For clone
ImageJ 1.5.0	/	/	For greyscale analysis
Large filter	Thermo Fisher	NEST	For filtering
Laser scanning confocal microscopy	Leica SP8		For subcellular localization
Ni sepharose excel	Cytiva	10339806	For protein purification
Precast protein plus gel	YEASEN	36246ES10	For SDS-PAGE
Small filter	Nalgene	1660045	For filtering
SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit	Thermo Fisher	34076	For western blotting
Triton X-100	SCR	30188928	To configure the extraction buffer
Type rotaryvang vacuum pump	Zhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company	2XZ-2	For vacuum infiltration
Vertical mixer	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited company	BE-1200	For mixing
β-mercaptoethanol	SIGMA	BCBK8223V	To configure the extraction buffer