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La purificazione delle proteine ricombinanti dai sistemi vegetali è solitamente messa alla prova dalle proteine vegetali. Questo lavoro fornisce un metodo per estrarre e purificare efficacemente una proteina ricombinante secreta dall'apoplasto di Nicotiana benthamiana.
Le piante sono un sistema di espressione eucariotica in via di sviluppo che viene esplorato per produrre proteine terapeutiche. La purificazione delle proteine ricombinanti dalle piante è una delle fasi più critiche del processo di produzione. In genere, le proteine sono state purificate da proteine solubili totali (TSP) e la presenza di varie proteine intracellulari e citocromi pone sfide per le successive fasi di purificazione delle proteine. Inoltre, la maggior parte delle proteine terapeutiche come antigeni e anticorpi vengono secrete per ottenere una corretta glicosilazione e la presenza di proteine non completamente modificate porta a strutture incoerenti di antigeni o anticorpi. Questo lavoro introduce un metodo più efficace per ottenere proteine ricombinanti altamente purificate dallo spazio apoplastico delle piante. La proteina fluorescente verde ricombinante (GFP) è ingegnerizzata per essere secreta nell'apoplasto di Nicotiana benthamiana e viene quindi estratta utilizzando un metodo di infiltrazione-centrifugazione. La GFP-His dell'apoplasto estratto viene quindi purificata mediante cromatografia di affinità con nichel. A differenza dei metodi tradizionali del TSP, la purificazione dall'apoplast produce proteine ricombinanti altamente purificate. Questo rappresenta un importante miglioramento tecnologico per i sistemi di produzione degli impianti.
Al giorno d'oggi, sono in fase di studio varie proteine terapeutiche ricombinanti prodotte dalle piante, tra cui anticorpi, vaccini, proteine bioattive, enzimi e piccoli polipeptidi 1,2,3,4,5,6. Le piante stanno diventando una piattaforma sempre più utilizzata per la produzione di proteine terapeutiche grazie alla loro sicurezza, al basso costo e alla capacità di scalare rapidamente la produzione 7,8. L'espression....
1. Preparazione delle piante di N. benthamiana
GFP-His è bersaglio della secrezione nello spazio apoplastico di N. benthamiana
La GFP è stata clonata nel plasmide pCAMBIA1300 con un peptide segnale PR1a N-terminale per la secrezione e un His-tag C-terminale per la purificazione, generando p35s-PR1a-GFP-His (Figura 1A). La proteina ricombinante è stata espressa transitoriamente in N. benthamiana e una banda di 30 kDa è stata rilevata mediante western blot utilizzando anticorpi ant.......
L'uso delle piante per produrre proteine terapeutiche si è espanso rapidamente negli ultimi anni 1,2,3,4,5,6. I geni codificanti le proteine vengono clonati in vettori di espressione e trasportati nei tessuti vegetali tramite agroinfiltrazione. Dopo la produzione da parte delle cellule vegetali, le proteine vengono purificat.......
Questo lavoro è sostenuto dall'Associazione per la promozione dell'innovazione giovanile CAS (2021084) e dal Fondo di sostegno al progetto di distribuzione chiave del piano d'azione triennale dell'Istituto di microbiologia, Accademia cinese delle scienze.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 mesh nylon fine mesh yarn | Guangzhou Huayu Trading limited company | hy-230724-2 | For AWF protein extraction |
50 ml centrifuge tubes | Vazyme | TCF00150 | For centrifuge |
ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme | C112-02 | For clone |
FastDigest Sac1 | NEB | R3156S | For clone |
FastDigest XbaI | NEB | FD0685 | For clone |
ImageJ 1.5.0 | / | / | For greyscale analysis |
Large filter | Thermo Fisher | NEST | For filtering |
Laser scanning confocal microscopy | Leica SP8 | For subcellular localization | |
Ni sepharose excel | Cytiva | 10339806 | For protein purification |
Precast protein plus gel | YEASEN | 36246ES10 | For SDS-PAGE |
Small filter | Nalgene | 1660045 | For filtering |
SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit | Thermo Fisher | 34076 | For western blotting |
Triton X-100 | SCR | 30188928 | To configure the extraction buffer |
Type rotaryvang vacuum pump | Zhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company | 2XZ-2 | For vacuum infiltration |
Vertical mixer | Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited company | BE-1200 | For mixing |
β-mercaptoethanol | SIGMA | BCBK8223V | To configure the extraction buffer |
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