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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

La purificazione delle proteine ricombinanti dai sistemi vegetali è solitamente messa alla prova dalle proteine vegetali. Questo lavoro fornisce un metodo per estrarre e purificare efficacemente una proteina ricombinante secreta dall'apoplasto di Nicotiana benthamiana.

Abstract

Le piante sono un sistema di espressione eucariotica in via di sviluppo che viene esplorato per produrre proteine terapeutiche. La purificazione delle proteine ricombinanti dalle piante è una delle fasi più critiche del processo di produzione. In genere, le proteine sono state purificate da proteine solubili totali (TSP) e la presenza di varie proteine intracellulari e citocromi pone sfide per le successive fasi di purificazione delle proteine. Inoltre, la maggior parte delle proteine terapeutiche come antigeni e anticorpi vengono secrete per ottenere una corretta glicosilazione e la presenza di proteine non completamente modificate porta a strutture incoerenti di antigeni o anticorpi. Questo lavoro introduce un metodo più efficace per ottenere proteine ricombinanti altamente purificate dallo spazio apoplastico delle piante. La proteina fluorescente verde ricombinante (GFP) è ingegnerizzata per essere secreta nell'apoplasto di Nicotiana benthamiana e viene quindi estratta utilizzando un metodo di infiltrazione-centrifugazione. La GFP-His dell'apoplasto estratto viene quindi purificata mediante cromatografia di affinità con nichel. A differenza dei metodi tradizionali del TSP, la purificazione dall'apoplast produce proteine ricombinanti altamente purificate. Questo rappresenta un importante miglioramento tecnologico per i sistemi di produzione degli impianti.

Introduction

Al giorno d'oggi, sono in fase di studio varie proteine terapeutiche ricombinanti prodotte dalle piante, tra cui anticorpi, vaccini, proteine bioattive, enzimi e piccoli polipeptidi 1,2,3,4,5,6. Le piante stanno diventando una piattaforma sempre più utilizzata per la produzione di proteine terapeutiche grazie alla loro sicurezza, al basso costo e alla capacità di scalare rapidamente la produzione 7,8. L'espression....

Protocol

1. Preparazione delle piante di N. benthamiana

  1. Mettere i blocchi di piantina in un vassoio, aggiungere 1 L di acqua e immergere per circa 2 ore fino a completa saturazione.
  2. Cospargere uniformemente i semi di N. benthamiana selvatici sui blocchi della piantina, coprire con un coperchio e germinare per 1 settimana. Coltiva N. benthamiana in serra con fotoperiodo di 18 ore, 24 °C, 45% di umidità relativa e concima ogni 2 sett.......

Representative Results

GFP-His è bersaglio della secrezione nello spazio apoplastico di N. benthamiana
La GFP è stata clonata nel plasmide pCAMBIA1300 con un peptide segnale PR1a N-terminale per la secrezione e un His-tag C-terminale per la purificazione, generando p35s-PR1a-GFP-His (Figura 1A). La proteina ricombinante è stata espressa transitoriamente in N. benthamiana e una banda di 30 kDa è stata rilevata mediante western blot utilizzando anticorpi ant.......

Discussion

L'uso delle piante per produrre proteine terapeutiche si è espanso rapidamente negli ultimi anni 1,2,3,4,5,6. I geni codificanti le proteine vengono clonati in vettori di espressione e trasportati nei tessuti vegetali tramite agroinfiltrazione. Dopo la produzione da parte delle cellule vegetali, le proteine vengono purificat.......

Acknowledgements

Questo lavoro è sostenuto dall'Associazione per la promozione dell'innovazione giovanile CAS (2021084) e dal Fondo di sostegno al progetto di distribuzione chiave del piano d'azione triennale dell'Istituto di microbiologia, Accademia cinese delle scienze.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mesh nylon fine mesh yarnGuangzhou Huayu Trading limited companyhy-230724-2For AWF protein extraction
50 ml centrifuge tubesVazymeTCF00150For centrifuge
ClonExpress II one step cloning kitVazymeC112-02For clone
FastDigest Sac1NEBR3156SFor clone
FastDigest XbaINEBFD0685For clone
ImageJ 1.5.0//For greyscale analysis
Large filterThermo FisherNESTFor filtering
Laser scanning confocal microscopyLeica SP8For subcellular localization
Ni sepharose excelCytiva10339806For protein purification
Precast protein plus gelYEASEN36246ES10For SDS-PAGE
Small filterNalgene1660045For filtering
SuperSignal West Femto Substrate Trial KitThermo Fisher34076For western blotting
Triton X-100SCR30188928To configure the extraction buffer
Type rotaryvang vacuum pumpZhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company2XZ-2For vacuum infiltration
Vertical mixerHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited companyBE-1200For mixing
β-mercaptoethanolSIGMABCBK8223VTo configure the extraction buffer

References

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