Metodo basato sull'estrazione di Apoplast per migliorare la purezza delle proteine ricombinanti prodotte dalle piante

Summary

La purificazione delle proteine ricombinanti dai sistemi vegetali è solitamente messa alla prova dalle proteine vegetali. Questo lavoro fornisce un metodo per estrarre e purificare efficacemente una proteina ricombinante secreta dall'apoplasto di Nicotiana benthamiana.

Abstract

Le piante sono un sistema di espressione eucariotica in via di sviluppo che viene esplorato per produrre proteine terapeutiche. La purificazione delle proteine ricombinanti dalle piante è una delle fasi più critiche del processo di produzione. In genere, le proteine sono state purificate da proteine solubili totali (TSP) e la presenza di varie proteine intracellulari e citocromi pone sfide per le successive fasi di purificazione delle proteine. Inoltre, la maggior parte delle proteine terapeutiche come antigeni e anticorpi vengono secrete per ottenere una corretta glicosilazione e la presenza di proteine non completamente modificate porta a strutture incoerenti di antigeni o anticorpi. Questo lavoro introduce un metodo più efficace per ottenere proteine ricombinanti altamente purificate dallo spazio apoplastico delle piante. La proteina fluorescente verde ricombinante (GFP) è ingegnerizzata per essere secreta nell'apoplasto di Nicotiana benthamiana e viene quindi estratta utilizzando un metodo di infiltrazione-centrifugazione. La GFP-His dell'apoplasto estratto viene quindi purificata mediante cromatografia di affinità con nichel. A differenza dei metodi tradizionali del TSP, la purificazione dall'apoplast produce proteine ricombinanti altamente purificate. Questo rappresenta un importante miglioramento tecnologico per i sistemi di produzione degli impianti.

Introduction

Al giorno d'oggi, sono in fase di studio varie proteine terapeutiche ricombinanti prodotte dalle piante, tra cui anticorpi, vaccini, proteine bioattive, enzimi e piccoli polipeptidi 1,2,3,4,5,6. Le piante stanno diventando una piattaforma sempre più utilizzata per la produzione di proteine terapeutiche grazie alla loro sicurezza, al basso costo e alla capacità di scalare rapidamente la produzione ^7,8. L'espression....

Protocol

1. Preparazione delle piante di N. benthamiana

1. Mettere i blocchi di piantina in un vassoio, aggiungere 1 L di acqua e immergere per circa 2 ore fino a completa saturazione.
2. Cospargere uniformemente i semi di N. benthamiana selvatici sui blocchi della piantina, coprire con un coperchio e germinare per 1 settimana. Coltiva N. benthamiana in serra con fotoperiodo di 18 ore, 24 °C, 45% di umidità relativa e concima ogni 2 sett.......

Discussion

L'uso delle piante per produrre proteine terapeutiche si è espanso rapidamente negli ultimi anni 1,2,3,4,5,6. I geni codificanti le proteine vengono clonati in vettori di espressione e trasportati nei tessuti vegetali tramite agroinfiltrazione. Dopo la produzione da parte delle cellule vegetali, le proteine vengono purificat.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mesh nylon fine mesh yarn	Guangzhou Huayu Trading limited company	hy-230724-2	For AWF protein extraction
50 ml centrifuge tubes	Vazyme	TCF00150	For centrifuge
ClonExpress II one step cloning kit	Vazyme	C112-02	For clone
FastDigest Sac1	NEB	R3156S	For clone
FastDigest XbaI	NEB	FD0685	For clone
ImageJ 1.5.0	/	/	For greyscale analysis
Large filter	Thermo Fisher	NEST	For filtering
Laser scanning confocal microscopy	Leica SP8		For subcellular localization
Ni sepharose excel	Cytiva	10339806	For protein purification
Precast protein plus gel	YEASEN	36246ES10	For SDS-PAGE
Small filter	Nalgene	1660045	For filtering
SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit	Thermo Fisher	34076	For western blotting
Triton X-100	SCR	30188928	To configure the extraction buffer
Type rotaryvang vacuum pump	Zhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company	2XZ-2	For vacuum infiltration
Vertical mixer	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited company	BE-1200	For mixing
β-mercaptoethanol	SIGMA	BCBK8223V	To configure the extraction buffer