Baker 中的线粒体转化

Summary

这项工作解释了如何使用生物方法转化酵母线粒体。我们还展示了如何选择和纯化转化体，以及如何在线粒体基因组中的靶位置引入所需的突变。

Abstract

几十年来，面包酵母酿酒 酵母已被广泛 用于了解线粒体生物学。该模型提供了有关真核生物中基本、保守的线粒体途径以及真菌或酵母特异性途径的知识。 酿酒酵母 的众多能力之一是操纵线粒体基因组的能力，到目前为止，这仅在 酿酒酵母 和单细胞藻类 莱茵衣藻中是可能的。酵母线粒体的生物转化使我们能够引入定点突变、进行基因重排并引入报告基因。这些方法主要用于了解线粒体中两个高度协调的过程的机制：线粒体核糖体的翻译以及呼吸复合物和 ATP 合酶的组装。然而，线粒体转化可能用于研究其他途径。在本工作中，我们展示了如何通过高速微弹轰击转化酵母线粒体，选择和纯化预期的转化体，并在线粒体基因组中引入所需的突变。

Introduction

酵母酿酒酵母是一种被广泛认可的用于研究线粒体生物发生的模型。由于酵母是一种厌氧的兼性生物，因此可以广泛研究引入损害呼吸的突变的原因和后果。此外，这种生物体拥有友好的遗传和生化工具来研究线粒体途径。然而，探索呼吸复合物组装和线粒体蛋白质合成机制的最强大资源之一是转化线粒体和修饰细胞器基因组的能力。以前，在线粒体 DNA （mtDNA） 中引入点突变或小缺失/插入 1,2,3,4,5，^删除基因 ^6,7，进行基因重排 ^7,8，为线粒体蛋白添加表位 ^9,10，将基因从细胞核重新定位到线粒体¹¹，¹²，并引入 BarStar

Protocol

注意：我们建议对每个构建体进行六次转化，因为线粒体转化效率通常较低。不同生长培养基的组成如 表 2 所示。

1. 钨颗粒制备

1. 在微管中称取 30 mg 0.7 μm 钨颗粒（WPs、微载体）。加入 1.5 mL 70% 乙醇 （EtOH） 进行灭菌。涡旋 WP 并让它们在室温下静置 10 分钟。
2. 在室温下以 13,200 x g 离心 15 分钟。向颗粒中加入 1.5 mL 无菌水，涡旋，.......

Discussion

目前的工作描述了 如何成功地转化 酵母中的线粒体。该过程从高速微弹轰击到纯化预期的酵母菌株，需要 ~8-12 周，具体取决于合成 ^{rho 菌株} 需要多少轮纯化。该方法的一些关键步骤如下。首先，线粒体基因构建体中突变位点周围添加的侧翼区域越大，靶突变成功整合的可能性就越高。侧翼区域的最小尺寸为 ~100 nt;但是，强烈建议在突变的每一侧使用超过 500 nt。其次，在选择转化?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tips	Axygen	T-1000-B
1.5 mL Microtube	Axygen	MCT-150-C
10 μL pipette tips	Axygen	T-10-C
15 mL conical bottom tube	Axygen	SCT-25ML-25-S
200 μL pipette tips	Axygen	T-200-Y
50 mL conical bottom  tube	Axygen	SCT-50ML-25-S
AfiII	New England BioLabs	R0520S
Agarose	SeaKem	50004
Analytic balance	OHAUS	ARA520
Autoclave	TOMY	ES-315
Bacto agar	BD	214010
Bacto peptone	BD	211677
Biolisitic Macrocarrier holder	BIO-RAD	1652322
Bunsen burner	VWR	89038-528
Calcium chloride	Fisher Scientific	C79-500
CSM -ADE	Formedium	DCS0049
CSM -ARG	Formedium	DCS0059
CSM -LEU	Formedium	DCS0099
CSM -URA	Formedium	DCS0169
Culture glass flask	KIMAX KIMBLE	25615
Culture glass tube	Pyrex	9820
Dextrose	BD	215520
Ethanol	JT Baker	9000
Forceps	Millipore	620006
Glass beads	Sigma	Z265926
Glass handle	Sigma	S4647
Glycerol	JT BAKER	2136-01
Helium tank grade 5 (99.99 %)	-	-
HSTaq  Kit	PCR BIO
Microcentrifugue	Eppendorf	022620100
NdeI	New England BioLabs	R0111L
Orbital shaker	New Brunswick scientific	NB-G25
PCR tubes	Axygen	PCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System	BIO-RAD	165-2257
Petri dishes (100X10)	BD	252777
QIAprep Spin Miniprep	Qiagen	27106
Raffinose	Formedium	RAF03
Replica plater	Scienceware	Z363391
Rupture discs 1350 Psi	BIO-RAD	1652330
Sorbitol	Sigma	S7547
Spermidine	Sigma	S0266
T4 DNA Ligase	Thermo Scientific	EL0011
Tissue Culture Rotator	Thermo Scientific	88882015
Tungsten microcarriers M10	BIO-RAD	1652266
Vaccum pump of 100L/min capacity	-	-
Velvet pads	Bel-Art	H37848-0002
Vortex	Scientifc Industries	SI-0236
Wood aplicator stick	PROMA	1820060
Yeast extract	BD	212750
Yeast Nitrogen base without aminoacids	BD	291920