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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

这项工作解释了如何使用生物方法转化酵母线粒体。我们还展示了如何选择和纯化转化体,以及如何在线粒体基因组中的靶位置引入所需的突变。

Abstract

几十年来,面包酵母酿酒 酵母已被广泛 用于了解线粒体生物学。该模型提供了有关真核生物中基本、保守的线粒体途径以及真菌或酵母特异性途径的知识。 酿酒酵母 的众多能力之一是操纵线粒体基因组的能力,到目前为止,这仅在 酿酒酵母 和单细胞藻类 莱茵衣藻中是可能的。酵母线粒体的生物转化使我们能够引入定点突变、进行基因重排并引入报告基因。这些方法主要用于了解线粒体中两个高度协调的过程的机制:线粒体核糖体的翻译以及呼吸复合物和 ATP 合酶的组装。然而,线粒体转化可能用于研究其他途径。在本工作中,我们展示了如何通过高速微弹轰击转化酵母线粒体,选择和纯化预期的转化体,并在线粒体基因组中引入所需的突变。

Introduction

酵母酿酒酵母是一种被广泛认可的用于研究线粒体生物发生的模型。由于酵母是一种厌氧的兼性生物,因此可以广泛研究引入损害呼吸的突变的原因和后果。此外,这种生物体拥有友好的遗传和生化工具来研究线粒体途径。然而,探索呼吸复合物组装和线粒体蛋白质合成机制的最强大资源之一是转化线粒体和修饰细胞器基因组的能力。以前,在线粒体 DNA (mtDNA) 中引入点突变或小缺失/插入 1,2,3,4,5删除基因 6,7,进行基因重排 7,8,为线粒体蛋白添加表9,10,将基因从细胞核重新定位到线粒体1112,并引入 BarStar

Protocol

注意:我们建议对每个构建体进行六次转化,因为线粒体转化效率通常较低。不同生长培养基的组成如 表 2 所示。

1. 钨颗粒制备

  1. 在微管中称取 30 mg 0.7 μm 钨颗粒(WPs、微载体)。加入 1.5 mL 70% 乙醇 (EtOH) 进行灭菌。涡旋 WP 并让它们在室温下静置 10 分钟。
  2. 在室温下以 13,200 x g 离心 15 分钟。向颗粒中加入 1.5 mL 无菌水,涡旋,.......

Representative Results

本节介绍了线粒体转化不同阶段的一些代表性结果。图 6 显示了轰炸程序。合成的 rho-cell 携带带有报告基因 ARG8m 的细菌质粒,它将取代线粒体基因的编码序列(图 6A)。轰击后,在缺乏尿嘧啶 (-URA) 的培养基上复制板;这是主板图 6B)。生长的菌落具有带有 URA3 营养缺陷型标记物的?.......

Discussion

目前的工作描述了 如何成功地转化 酵母中的线粒体。该过程从高速微弹轰击到纯化预期的酵母菌株,需要 ~8-12 周,具体取决于合成 rho 菌株 需要多少轮纯化。该方法的一些关键步骤如下。首先,线粒体基因构建体中突变位点周围添加的侧翼区域越大,靶突变成功整合的可能性就越高。侧翼区域的最小尺寸为 ~100 nt;但是,强烈建议在突变的每一侧使用超过 500 nt。其次,在选择转化?.......

Acknowledgements

本出版物得到了 Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT)、UNAM [IN223623 to XP-M] 的支持。UPD 是 CONAHCYT 研究员 (CVU:883299)。我们要感谢 Ariann Mendoza-Martínez 博士在光学显微镜图像方面提供的技术帮助。生物渲染许可证:DU26OMVLUU(图 2);BK26TH9GXH(图 3);GD26TH80R5(图 4);PU26THARYD(图 7);ML26THAIFG(图 9)。

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL pipette tipsAxygenT-1000-B
1.5 mL MicrotubeAxygenMCT-150-C
10 μL pipette tipsAxygenT-10-C
15 mL conical bottom tube AxygenSCT-25ML-25-S
200 μL pipette tipsAxygenT-200-Y
50 mL conical bottom  tubeAxygenSCT-50ML-25-S
AfiIINew England BioLabsR0520S
AgaroseSeaKem50004
Analytic balanceOHAUSARA520
AutoclaveTOMYES-315
Bacto agarBD214010
Bacto peptoneBD211677
Biolisitic Macrocarrier holder BIO-RAD1652322
Bunsen burnerVWR89038-528
Calcium chlorideFisher ScientificC79-500
CSM -ADEFormediumDCS0049
CSM -ARGFormediumDCS0059
CSM -LEUFormediumDCS0099
CSM -URAFormediumDCS0169
Culture glass flaskKIMAX KIMBLE25615
Culture glass tubePyrex9820
DextroseBD215520
EthanolJT Baker 9000
ForcepsMillipore620006
Glass beadsSigmaZ265926
Glass handleSigmaS4647
GlycerolJT BAKER2136-01
Helium tank grade 5 (99.99 %)--
HSTaq  KitPCR BIO
MicrocentrifugueEppendorf022620100
NdeINew England BioLabsR0111L
Orbital shakerNew Brunswick scientificNB-G25
PCR tubesAxygenPCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery SystemBIO-RAD165-2257
Petri dishes (100X10)BD252777
QIAprep Spin MiniprepQiagen27106
RaffinoseFormediumRAF03
Replica platerSciencewareZ363391
Rupture discs 1350 PsiBIO-RAD1652330
SorbitolSigmaS7547
SpermidineSigmaS0266
T4 DNA LigaseThermo ScientificEL0011
Tissue Culture RotatorThermo Scientific88882015
Tungsten microcarriers M10BIO-RAD1652266
Vaccum pump of 100L/min capacity--
Velvet padsBel-ArtH37848-0002
Vortex Scientifc IndustriesSI-0236
Wood aplicator stickPROMA1820060
Yeast extractBD212750
Yeast Nitrogen base without aminoacidsBD291920

References

  1. Bonnefoy, N., Fox, T. D. In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation. Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).
  2. Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. <....

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