טרנספורמציה מיטוכונדריאלית בבייקר

Summary

עבודה זו מסבירה כיצד לשנות מיטוכונדריה של שמרים באמצעות שיטה ביוליסטית. אנו גם מראים כיצד לבחור ולטהר את הטרנספורמנטים וכיצד להציג את המוטציה הרצויה במיקום המטרה בתוך הגנום המיטוכונדריאלי.

Abstract

שמרי אפייה Saccharomyces cerevisiae נמצאים בשימוש נרחב להבנת הביולוגיה של המיטוכונדריה מזה עשרות שנים. מודל זה סיפק ידע על מסלולים מיטוכונדריאליים חיוניים ושמורים בקרב איקריוטים, ומסלולים ספציפיים לפטריות או שמרים. אחת היכולות הרבות של S. cerevisiae היא היכולת לתמרן את הגנום המיטוכונדריאלי, אשר עד כה אפשרי רק ב - S. cerevisiae ובאצות החד-תאיות Chlamydomonas reinhardtii. השינוי הביולוגי של מיטוכונדריית שמרים מאפשר לנו להציג מוטציות מכוונות אתר, לבצע סידורים מחדש של גנים ולהציג כתבים. גישות אלה משמשות בעיקר להבנת המנגנונים של שני תהליכים מתואמים מאוד במיטוכונדריה: תרגום על ידי מיטוריבוזומים והרכבה של קומפלקסים נשימתיים וסינתאז ATP. עם זאת, טרנספורמציה מיטוכונדריאלית יכולה לשמש באופן פוטנציאלי לחקר מסלולים אחרים. בעבודה הנוכחית אנו מראים כיצד לשנות מיטוכונדריה של שמרים באמצעות הפצצת מיקרו-קליע במהירות גבוהה, לבחור ולטהר את הטרנספורמציה המיועדת, ולהציג את המוטציה הרצויה בגנום המיטוכונדריאלי.

Introduction

שמרי Saccharomyces cerevisiae הם מודל מוכר המשמש לחקר ביוגנזה מיטוכונדריאלית. מכיוון ששמרים הם אורגניזם אנאירובי, פקולטטיבי, ניתן ללמוד בהרחבה את הסיבות וההשלכות של החדרת מוטציות הפוגעות בנשימה. בנוסף, אורגניזם זה בעל כלים גנטיים וביוכימיים ידידותיים לחקר מסלולים מיטוכונדריאליים. עם זאת, אחד המשאבים החזקים ביותר לחקור את מנגנוני הרכבת קומפלקס הנשימה וסינתזה של חלבון מיטוכונדריאלי הוא היכולת לשנות מיטוכונדריה ולשנות את הגנום של אברונים. בעבר, היה מועיל להכניס לדנ"א המיטוכונדריאלי (mtDNA) מוטציות נקודתיות או מחיקות/החדרות קטנות 1,2,3,4,5, למחוק גנים

Protocol

הערה: אנו ממליצים לבצע שש טרנספורמציות עבור כל מבנה מכיוון שיעילות הטרנספורמציה המיטוכונדריאלית היא בדרך כלל נמוכה. הרכב מצעי הגידול השונים מוצג בטבלה 2.

1. הכנת חלקיקי טונגסטן

1. שקלו 30 מ"ג של חלקיקי טונגסטן 0.7 מיקרומטר (WPs, מיקרו-נשאים) במיקרו-צינור. הוסף.......

Discussion

העבודה הנוכחית תיארה כיצד להפוך מיטוכונדריה מהשמרים S. cerevisiae בהצלחה. התהליך, מהפצצת מיקרו-קליע במהירות גבוהה ועד לטיהור זן השמרים המיועד, אורך ~8-12 שבועות, תלוי בכמה סבבי טיהור ^{של זן הרו} הסינתטי הדרושים. חלק מהשלבים הקריטיים של השיטה הם כדלקמן. ראשית, ככל שאזורי האיגוף שנוספו סביב .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tips	Axygen	T-1000-B
1.5 mL Microtube	Axygen	MCT-150-C
10 μL pipette tips	Axygen	T-10-C
15 mL conical bottom tube	Axygen	SCT-25ML-25-S
200 μL pipette tips	Axygen	T-200-Y
50 mL conical bottom  tube	Axygen	SCT-50ML-25-S
AfiII	New England BioLabs	R0520S
Agarose	SeaKem	50004
Analytic balance	OHAUS	ARA520
Autoclave	TOMY	ES-315
Bacto agar	BD	214010
Bacto peptone	BD	211677
Biolisitic Macrocarrier holder	BIO-RAD	1652322
Bunsen burner	VWR	89038-528
Calcium chloride	Fisher Scientific	C79-500
CSM -ADE	Formedium	DCS0049
CSM -ARG	Formedium	DCS0059
CSM -LEU	Formedium	DCS0099
CSM -URA	Formedium	DCS0169
Culture glass flask	KIMAX KIMBLE	25615
Culture glass tube	Pyrex	9820
Dextrose	BD	215520
Ethanol	JT Baker	9000
Forceps	Millipore	620006
Glass beads	Sigma	Z265926
Glass handle	Sigma	S4647
Glycerol	JT BAKER	2136-01
Helium tank grade 5 (99.99 %)	-	-
HSTaq  Kit	PCR BIO
Microcentrifugue	Eppendorf	022620100
NdeI	New England BioLabs	R0111L
Orbital shaker	New Brunswick scientific	NB-G25
PCR tubes	Axygen	PCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System	BIO-RAD	165-2257
Petri dishes (100X10)	BD	252777
QIAprep Spin Miniprep	Qiagen	27106
Raffinose	Formedium	RAF03
Replica plater	Scienceware	Z363391
Rupture discs 1350 Psi	BIO-RAD	1652330
Sorbitol	Sigma	S7547
Spermidine	Sigma	S0266
T4 DNA Ligase	Thermo Scientific	EL0011
Tissue Culture Rotator	Thermo Scientific	88882015
Tungsten microcarriers M10	BIO-RAD	1652266
Vaccum pump of 100L/min capacity	-	-
Velvet pads	Bel-Art	H37848-0002
Vortex	Scientifc Industries	SI-0236
Wood aplicator stick	PROMA	1820060
Yeast extract	BD	212750
Yeast Nitrogen base without aminoacids	BD	291920