Trasformazione mitocondriale in Baker

Summary

Questo lavoro spiega come trasformare i mitocondri del lievito utilizzando un metodo biolistico. Mostriamo anche come selezionare e purificare i trasformanti e come introdurre la mutazione desiderata nella posizione target all'interno del genoma mitocondriale.

Abstract

Il lievito di birra Saccharomyces cerevisiae è stato ampiamente utilizzato per decenni per comprendere la biologia mitocondriale. Questo modello ha fornito conoscenze sulle vie mitocondriali essenziali e conservate tra gli eucarioti e sulle vie specifiche dei funghi o dei lieviti. Una delle molte capacità di S. cerevisiae è la capacità di manipolare il genoma mitocondriale, che finora è possibile solo in S. cerevisiae e nelle alghe unicellulari Chlamydomonas reinhardtii. La trasformazione biolistica dei mitocondri del lievito ci permette di introdurre mutazioni sito-dirette, effettuare riarrangiamenti genici e introdurre reporter. Questi approcci sono utilizzati principalmente per comprendere i meccanismi di due processi altamente coordinati nei mitocondri: la traduzione da parte dei mitoribosomi e l'assemblaggio di complessi respiratori e ATP sintasi. Tuttavia, la trasformazione mitocondriale può potenzialmente essere utilizzata per studiare altri percorsi. Nel presente lavoro, mostriamo come trasformare i mitocondri del lievito mediante bombardamento di microproiettili ad alta velocità, selezionare e purificare il trasformante desiderato e introdurre la mutazione desiderata nel genoma mitocondriale.

Introduction

Il lievito Saccharomyces cerevisiae è un modello ampiamente riconosciuto utilizzato per studiare la biogenesi mitocondriale. Poiché il lievito è un organismo anaerobio e facoltativo, è possibile studiare ampiamente le cause e le conseguenze dell'introduzione di mutazioni che compromettono la respirazione. Inoltre, questo organismo possiede strumenti genetici e biochimici amichevoli per studiare le vie mitocondriali. Tuttavia, una delle risorse più potenti per esplorare i meccanismi dell'assemblaggio dei complessi respiratori e della sintesi proteica mitocondriale è la capacità di trasformare i mitocondri e modificare il genoma dell'organello. In precedenza, è....

Protocol

NOTA: Si consiglia di effettuare sei trasformazioni per ogni costrutto poiché l'efficienza della trasformazione mitocondriale è solitamente bassa. La composizione dei diversi mezzi di crescita è mostrata nella Tabella 2.

1. Preparazione delle particelle di tungsteno

1. Pesare 30 mg di particelle di tungsteno da 0,7 μm (WP, microcarrier) in una microprovetta. Aggiungere 1,5 ml di etanolo al 70% (EtOH) per sterilizzare. Agitare i WP e lasciarli riposa.......

Discussion

Il presente lavoro descrive come trasformare con successo i mitocondri dal lievito S. cerevisiae. Il processo, dal bombardamento di microproiettili ad alta velocità fino alla purificazione del ceppo di lievito previsto, richiede ~8-12 settimane, a seconda di quanti cicli di purificazione del ceppo sintetico di rho^- sono necessari. Alcuni dei passaggi critici del metodo sono i seguenti. In primo luogo, più grandi sono le regioni fiancheggianti aggiunte intorno al sito di mutazione nel costrutto genic.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tips	Axygen	T-1000-B
1.5 mL Microtube	Axygen	MCT-150-C
10 μL pipette tips	Axygen	T-10-C
15 mL conical bottom tube	Axygen	SCT-25ML-25-S
200 μL pipette tips	Axygen	T-200-Y
50 mL conical bottom  tube	Axygen	SCT-50ML-25-S
AfiII	New England BioLabs	R0520S
Agarose	SeaKem	50004
Analytic balance	OHAUS	ARA520
Autoclave	TOMY	ES-315
Bacto agar	BD	214010
Bacto peptone	BD	211677
Biolisitic Macrocarrier holder	BIO-RAD	1652322
Bunsen burner	VWR	89038-528
Calcium chloride	Fisher Scientific	C79-500
CSM -ADE	Formedium	DCS0049
CSM -ARG	Formedium	DCS0059
CSM -LEU	Formedium	DCS0099
CSM -URA	Formedium	DCS0169
Culture glass flask	KIMAX KIMBLE	25615
Culture glass tube	Pyrex	9820
Dextrose	BD	215520
Ethanol	JT Baker	9000
Forceps	Millipore	620006
Glass beads	Sigma	Z265926
Glass handle	Sigma	S4647
Glycerol	JT BAKER	2136-01
Helium tank grade 5 (99.99 %)	-	-
HSTaq  Kit	PCR BIO
Microcentrifugue	Eppendorf	022620100
NdeI	New England BioLabs	R0111L
Orbital shaker	New Brunswick scientific	NB-G25
PCR tubes	Axygen	PCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System	BIO-RAD	165-2257
Petri dishes (100X10)	BD	252777
QIAprep Spin Miniprep	Qiagen	27106
Raffinose	Formedium	RAF03
Replica plater	Scienceware	Z363391
Rupture discs 1350 Psi	BIO-RAD	1652330
Sorbitol	Sigma	S7547
Spermidine	Sigma	S0266
T4 DNA Ligase	Thermo Scientific	EL0011
Tissue Culture Rotator	Thermo Scientific	88882015
Tungsten microcarriers M10	BIO-RAD	1652266
Vaccum pump of 100L/min capacity	-	-
Velvet pads	Bel-Art	H37848-0002
Vortex	Scientifc Industries	SI-0236
Wood aplicator stick	PROMA	1820060
Yeast extract	BD	212750
Yeast Nitrogen base without aminoacids	BD	291920