Transformação mitocondrial em Baker

Summary

Este trabalho explica como transformar mitocôndrias de levedura usando um método biolístico. Também mostramos como selecionar e purificar os transformantes e como introduzir a mutação desejada na posição alvo dentro do genoma mitocondrial.

Abstract

A levedura de padeiro Saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente utilizada para entender a biologia mitocondrial há décadas. Este modelo forneceu conhecimento sobre vias mitocondriais essenciais e conservadas entre eucariotos e fungos ou vias específicas de leveduras. Uma das muitas habilidades de S. cerevisiae é a capacidade de manipular o genoma mitocondrial, o que até agora só é possível em S. cerevisiae e na alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii. A transformação biolística das mitocôndrias de levedura nos permite introduzir mutações dirigidas ao local, fazer rearranjos genéticos e introduzir repórteres. Essas abordagens são usadas principalmente para entender os mecanismos de dois processos altamente coordenados nas mitocôndrias: tradução por mitorribossomos e montagem de complexos respiratórios e ATP sintase. No entanto, a transformação mitocondrial pode potencialmente ser usada para estudar outras vias. No presente trabalho, mostramos como transformar mitocôndrias de leveduras por bombardeio de microprojéteis de alta velocidade, selecionar e purificar o transformante pretendido e introduzir a mutação desejada no genoma mitocondrial.

Introduction

A levedura Saccharomyces cerevisiae é um modelo amplamente reconhecido usado para estudar a biogênese mitocondrial. Como a levedura é um organismo anaeróbico e facultativo, é possível estudar extensivamente as causas e consequências da introdução de mutações que prejudicam a respiração. Além disso, este organismo possui ferramentas genéticas e bioquímicas amigáveis para estudar as vias mitocondriais. No entanto, um dos recursos mais poderosos para explorar os mecanismos de montagem de complexos respiratórios e síntese de proteínas mitocondriais é a capacidade de transformar as mitocôndrias e modificar o genoma da organela. Anteriormente, foi útil introduzir n....

Protocol

NOTA: Recomendamos fazer seis transformações para cada construção, pois a eficiência da transformação mitocondrial geralmente é baixa. A composição dos diferentes meios de crescimento é mostrada na Tabela 2.

1. Preparação de partículas de tungstênio

1. Pesar 30 mg de partículas de tungstênio de 0,7 μm (WPs, microtransportadores) em um microtubo. Adicione 1,5 mL de etanol a 70% (EtOH) para esterilizar. Vortex os WPs e deixe-os descansar.......

Discussion

O presente trabalho descreveu como transformar mitocôndrias da levedura S. cerevisiae com sucesso. O processo, desde o bombardeio de microprojéteis de alta velocidade até a purificação da cepa de levedura pretendida, leva ~ 8-12 semanas, dependendo de quantas rodadas de purificação da cepa de rho^- sintética são necessárias. Algumas das etapas críticas do método são as seguintes. Primeiro, quanto maiores as regiões flanqueadoras adicionadas ao redor do local da mutação na construção d.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tips	Axygen	T-1000-B
1.5 mL Microtube	Axygen	MCT-150-C
10 μL pipette tips	Axygen	T-10-C
15 mL conical bottom tube	Axygen	SCT-25ML-25-S
200 μL pipette tips	Axygen	T-200-Y
50 mL conical bottom  tube	Axygen	SCT-50ML-25-S
AfiII	New England BioLabs	R0520S
Agarose	SeaKem	50004
Analytic balance	OHAUS	ARA520
Autoclave	TOMY	ES-315
Bacto agar	BD	214010
Bacto peptone	BD	211677
Biolisitic Macrocarrier holder	BIO-RAD	1652322
Bunsen burner	VWR	89038-528
Calcium chloride	Fisher Scientific	C79-500
CSM -ADE	Formedium	DCS0049
CSM -ARG	Formedium	DCS0059
CSM -LEU	Formedium	DCS0099
CSM -URA	Formedium	DCS0169
Culture glass flask	KIMAX KIMBLE	25615
Culture glass tube	Pyrex	9820
Dextrose	BD	215520
Ethanol	JT Baker	9000
Forceps	Millipore	620006
Glass beads	Sigma	Z265926
Glass handle	Sigma	S4647
Glycerol	JT BAKER	2136-01
Helium tank grade 5 (99.99 %)	-	-
HSTaq  Kit	PCR BIO
Microcentrifugue	Eppendorf	022620100
NdeI	New England BioLabs	R0111L
Orbital shaker	New Brunswick scientific	NB-G25
PCR tubes	Axygen	PCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System	BIO-RAD	165-2257
Petri dishes (100X10)	BD	252777
QIAprep Spin Miniprep	Qiagen	27106
Raffinose	Formedium	RAF03
Replica plater	Scienceware	Z363391
Rupture discs 1350 Psi	BIO-RAD	1652330
Sorbitol	Sigma	S7547
Spermidine	Sigma	S0266
T4 DNA Ligase	Thermo Scientific	EL0011
Tissue Culture Rotator	Thermo Scientific	88882015
Tungsten microcarriers M10	BIO-RAD	1652266
Vaccum pump of 100L/min capacity	-	-
Velvet pads	Bel-Art	H37848-0002
Vortex	Scientifc Industries	SI-0236
Wood aplicator stick	PROMA	1820060
Yeast extract	BD	212750
Yeast Nitrogen base without aminoacids	BD	291920