Митохондриальная трансформация у Бейкера

Summary

В этой работе объясняется, как трансформировать митохондрии дрожжей с помощью биолистического метода. Мы также показываем, как отбирать и очищать трансформанты и как ввести желаемую мутацию в целевую позицию в митохондриальном геноме.

Abstract

Пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae широко используются для понимания митохондриальной биологии на протяжении десятилетий. Эта модель предоставила знания об основных консервативных митохондриальных путях у эукариот, а также о грибах или дрожжевых путях. Одной из многих способностей S. cerevisiae является способность манипулировать митохондриальным геномом, что до сих пор было возможно только у S. cerevisiae и одноклеточных водорослей Chlamydomonas reinhardtii. Биолистическая трансформация митохондрий дрожжей позволяет нам вводить сайт-направленные мутации, производить перестройку генов и вводить репортеров. Эти подходы в основном используются для понимания механизмов двух высоко скоординированных процессов в митохондриях: трансляции миторибосомами и сборки дыхательных комплексов и АТФ-синтазы. Тем не менее, митохондриальная трансформация потенциально может быть использована для изучения других путей. В настоящей работе мы показываем, как трансформировать митохондрии дрожжей с помощью высокоскоростной бомбардировки микроснарядами, выбрать и очистить предполагаемый трансформант, а также ввести желаемую мутацию в митохондриальный геном.

Introduction

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются широко признанной моделью, используемой для изучения митохондриального биогенеза. Поскольку дрожжи являются анаэробным, факультативным организмом, можно широко изучить причины и последствия внесения мутаций, ухудшающих дыхание. Кроме того, этот организм обладает дружественными генетическими и биохимическими инструментами для изучения митохондриальных путей. Тем не менее, одним из самых мощных ресурсов для изучения механизмов сборки дыхательных комплексов и синтеза митохондриальных белков является способность трансформировать митохондрии и модифицировать геном органеллы. Ранее было полезно вводить в митохондриальную ДНК....

Protocol

Примечание: Мы рекомендуем проводить шесть трансформаций для каждого конструкта, так как эффективность митохондриального превращения обычно низкая. Состав различных питательных сред представлен в таблице 2.

1. Подготовка вольфрамовых частиц

1. Мас?.......

Discussion

В настоящей работе описано, как успешно трансформировать митохондрии из дрожжей S. cerevisiae . Процесс, начиная с высокоскоростной бомбардировки микроснарядами и заканчивая очисткой предполагаемого штамма дрожжей, занимает ~8-12 недель, в зависимости от того, сколько раундов очистки си?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tips	Axygen	T-1000-B
1.5 mL Microtube	Axygen	MCT-150-C
10 μL pipette tips	Axygen	T-10-C
15 mL conical bottom tube	Axygen	SCT-25ML-25-S
200 μL pipette tips	Axygen	T-200-Y
50 mL conical bottom  tube	Axygen	SCT-50ML-25-S
AfiII	New England BioLabs	R0520S
Agarose	SeaKem	50004
Analytic balance	OHAUS	ARA520
Autoclave	TOMY	ES-315
Bacto agar	BD	214010
Bacto peptone	BD	211677
Biolisitic Macrocarrier holder	BIO-RAD	1652322
Bunsen burner	VWR	89038-528
Calcium chloride	Fisher Scientific	C79-500
CSM -ADE	Formedium	DCS0049
CSM -ARG	Formedium	DCS0059
CSM -LEU	Formedium	DCS0099
CSM -URA	Formedium	DCS0169
Culture glass flask	KIMAX KIMBLE	25615
Culture glass tube	Pyrex	9820
Dextrose	BD	215520
Ethanol	JT Baker	9000
Forceps	Millipore	620006
Glass beads	Sigma	Z265926
Glass handle	Sigma	S4647
Glycerol	JT BAKER	2136-01
Helium tank grade 5 (99.99 %)	-	-
HSTaq  Kit	PCR BIO
Microcentrifugue	Eppendorf	022620100
NdeI	New England BioLabs	R0111L
Orbital shaker	New Brunswick scientific	NB-G25
PCR tubes	Axygen	PCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System	BIO-RAD	165-2257
Petri dishes (100X10)	BD	252777
QIAprep Spin Miniprep	Qiagen	27106
Raffinose	Formedium	RAF03
Replica plater	Scienceware	Z363391
Rupture discs 1350 Psi	BIO-RAD	1652330
Sorbitol	Sigma	S7547
Spermidine	Sigma	S0266
T4 DNA Ligase	Thermo Scientific	EL0011
Tissue Culture Rotator	Thermo Scientific	88882015
Tungsten microcarriers M10	BIO-RAD	1652266
Vaccum pump of 100L/min capacity	-	-
Velvet pads	Bel-Art	H37848-0002
Vortex	Scientifc Industries	SI-0236
Wood aplicator stick	PROMA	1820060
Yeast extract	BD	212750
Yeast Nitrogen base without aminoacids	BD	291920