大鼠肝脏灌注和原代肝细胞分离：一种对尖端 3D 类器官培养至关重要的旧程序

Summary

该方案在大鼠模型中提出了一种优化的两步胶原酶肝灌注技术，并展示了使用分离的肝细胞进行 3D 类器官的 体外 长期培养。

Abstract

原代肝细胞是 体外 肝脏相关研究的常用工具。然而，由于培养物中形态、活力和功能的快速丧失，这些细胞的维持一直是一个挑战。最近的一种长期培养方法是生成三维 （3D） 类器官，这是一种 体外 工具，可以根据肝脏奇妙的自我再生能力来概括培养皿中的组织。已发布的方案旨在从原代成体肝细胞 （Hep-Org） 获得长期功能性 3D 类器官。3D 类器官尖端工具需要能够从成人组织中分离细胞，而这一初始步骤对于获得高质量的最终结果至关重要。1970 年代引入的两步胶原酶灌注仍然是获得单个肝细胞的有效程序。本文旨在描述外科手术的所有关键步骤，从而优化大鼠模型中的原代肝细胞分离程序。此外，特别注意 PREPARE 指南，以增加手术成功的可能性并确保高质量的结果。详细的方案使研究人员能够加速和优化下游工作，以从原代成年大鼠肝细胞中建立 3D 类器官。与 2D 肝细胞相比，Hep-Orgs 在第 15 天仍然具有活力并处于活跃增殖状态，显示出长期潜力。

Introduction

原代肝细胞是 体外 肝脏相关研究中重要且广泛使用的工具。然而，它们的扩增和维持在历史上一直具有挑战性，因为它们在培养物中几天后就会失去形态和功能¹。2D 培养是一种限制条件，特别是对于具有多边形形状和极化结构以及分化的顶膜和基底外侧膜的肝细胞。事实上，肝细胞粘附在板上会干扰它们的正常活性，因为它会导致细胞骨架扁平，细胞之间以及细胞与细胞外基质 （ECM） 之间的相互作用有限，从而减少极化和所涉及的信号通路²。

为了绕过这种方法的局限性，Dunn 和同事³ 首先使用了胶原蛋白双层。这种培养方法称为“夹心培养法”，其基础是将原代肝细胞接种在基质的两层之间。这种方法具有许多优点，包括长期培养、维持多边形形态以及与新鲜分离的肝细胞相当的转录活性⁴。基于相同原理的类似方法，其中底层由 Matrigel 组成，而覆盖层由胶原蛋白组成，已经证明了存在完善的小管网络⁵。

尽管用于肝细胞生长的夹心培养方法可靠，但目前的工作期待建立 3D 类器官培养，这是一种用于概括培养皿中组织的体外工具，并形成通往个....

Protocol

所有程序和动物饲养均根据意大利法律和欧洲共同体指令的指导方针进行。根据第 26/2014 号法令第 31 条，实验方案已获得当地动物护理委员会和意大利卫生部（许可证编号 321/2022-PR）的批准。

1. 动物手术的准备

注：培养基和缓冲液成分请参阅 表 1 ，商业详情请参阅 材料表 。

1. 在 42 ?.......

Discussion

3D 类器官是个性化医疗的前沿领域，可实现长期肝细胞培养。这种创新技术的质量需要活的原代肝细胞的良好产量以及性能良好的肝脏灌注和肝细胞分离。这种旧程序仍然被广泛使用;但是，它包括可能具有挑战性的不同步骤。在接近该程序时，我们遇到了细菌污染、肝脏消化效率低、原代肝细胞产量低和肝细胞活力低等关键问题，所有这些都很容易影响技术的成功。从?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01- ALK5 Inhibitor IV	Twin Helix	T3031
B27	Thermofisher Scientific	0080085SA
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad
CHIR99021	Twin Helix	T2310
Click EdU Alexa 488 imaging kit	Thermofisher Scientific	C10499
Collagen, Type I, solution from rat tail	Merck	C3867-1VL
Dexamethasone	Merck	D4902
EGF	Merck	E9644
Fetal bovine serum (FBS)	Euroclone	ECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BME	Thermofisher Scientific	A1413202
Heparin Sodium 25000 IU/5 ml	B. Braun Melsungen AG	B01AB01
HGF	Peprotech	100-39H
Insulin-Transferrin-Selenium solution 100x	Thermofisher Scientific	41400045
L-Glutamine solution	Euroclone	ECB3000D
Liver Digest Medium	Thermofisher Scientific	17703-034
Liver Perfusion Medium	Thermofisher Scientific	17701038
N2 supplement	Thermofisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A9165
Nicotinamide	Merck	N-0636
Non-Essential Amino Acids	Merck	M7145
Normocin	Aurogene	ant-nr-1
PBS buffer 1X	PanReac AppliChem	A0964,9050
Penicillin-streptomycin solution 100x	Euroclone	ECB3001D
Percoll	Santa Cruz	sc-296039A
Peristaltic pump	Ismatec™	MS-4/12 Reglo Digital Pump
TNFa	Peprotech	300-01A
TRI Reagent	Merck	T9424
Tubing	Ismatec™	ID.2,79mm
Williams' E Medium, no glutamine	Thermofisher Scientific	31415029
Y27632	Twin Helix	T1725