Perfusione epatica di ratto e isolamento degli epatociti primari: una vecchia procedura cruciale per la coltura di organoidi 3D all'avanguardia

Summary

Questo protocollo presenta una tecnica ottimizzata di perfusione epatica della collagenasi in due fasi in un modello di ratto e mostra l'uso di epatociti isolati per la coltura in vitro a lungo termine di organoidi 3D.

Abstract

Gli epatociti primari sono uno strumento comunemente usato per gli studi in vitro correlati al fegato. Tuttavia, il mantenimento di queste cellule è sempre stato una sfida a causa della rapida perdita di morfologia, vitalità e funzionalità in coltura. Un approccio recente alla coltura a lungo termine è la generazione di organoidi tridimensionali (3D), uno strumento in vitro in grado di ricapitolare i tessuti in un piatto basato sulla meravigliosa capacità del fegato di rigenerarsi. I protocolli pubblicati sono stati progettati per ottenere organoidi 3D funzionali a lungo termine da epatociti adulti primari (Hep-Org). Lo strumento all'avanguardia per organoidi 3D richiede la capacità di isolare le cellule dal tessuto adulto e questo passaggio iniziale è fondamentale per un risultato finale di alta qualità. La perfusione collagenasi a due stadi, introdotta negli anni '70, è ancora una procedura valida per ottenere singoli epatociti. Il presente articolo si propone di descrivere tutte le fasi cruciali della procedura chirurgica, ottimizzando così la procedura di isolamento degli epatociti primari nel modello di ratto. Inoltre, particolare attenzione è rivolta alle linee guida PREPARE per aumentare la probabilità di successo delle procedure e garantire risultati di alta qualità. Un protocollo dettagliato consente ai ricercatori di accelerare e ottimizzare il lavoro a valle per stabilire organoidi 3D da epatociti di ratto adulti primari. Rispetto agli epatociti 2D, gli Hep-Org erano ancora vitali e in proliferazione attiva al giorno 15, dimostrando un potenziale a lungo termine.

Introduction

Gli epatociti primari sono uno strumento importante e ampiamente utilizzato per gli studi in vitro correlati al fegato. Tuttavia, la loro espansione e manutenzione sono state storicamente impegnative, poiché perdono morfologia e funzionalità dopo pochi giorni nella coltura¹. La coltura 2D è una condizione limitante, in particolare, per gli epatociti che hanno una forma poligonale e una struttura polarizzata con membrane apicali e basolaterali differenziate. Infatti, l'adesione degli epatociti alla piastra interferisce con la loro normale attività perché porta ad un citoscheletro piatto con interazione ....

Protocol

Tutte le procedure e la stabulazione degli animali sono state condotte secondo le linee guida della legge italiana e della direttiva della Comunità Europea. Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato per la Cura degli Animali e dal Ministero della Salute (autorizzazione n° 321/2022-PR) ai sensi dell'art.31 del decreto 26/2014.

1. Preparazione per la procedura con gli animali

NOTA: Fare riferimento al.......

Discussion

Gli organoidi 3D sono una frontiera per la medicina personalizzata e consentono una coltura di epatociti a lungo termine. La qualità di questa tecnica innovativa richiede una buona resa di epatociti primari vitali e una perfusione epatica e un isolamento degli epatociti ben eseguiti. Questa vecchia procedura è ancora ampiamente utilizzata; Tuttavia, comprende diversi passaggi che possono essere impegnativi. Avvicinandoci alla procedura, abbiamo riscontrato problemi critici come la cont.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01- ALK5 Inhibitor IV	Twin Helix	T3031
B27	Thermofisher Scientific	0080085SA
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad
CHIR99021	Twin Helix	T2310
Click EdU Alexa 488 imaging kit	Thermofisher Scientific	C10499
Collagen, Type I, solution from rat tail	Merck	C3867-1VL
Dexamethasone	Merck	D4902
EGF	Merck	E9644
Fetal bovine serum (FBS)	Euroclone	ECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BME	Thermofisher Scientific	A1413202
Heparin Sodium 25000 IU/5 ml	B. Braun Melsungen AG	B01AB01
HGF	Peprotech	100-39H
Insulin-Transferrin-Selenium solution 100x	Thermofisher Scientific	41400045
L-Glutamine solution	Euroclone	ECB3000D
Liver Digest Medium	Thermofisher Scientific	17703-034
Liver Perfusion Medium	Thermofisher Scientific	17701038
N2 supplement	Thermofisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A9165
Nicotinamide	Merck	N-0636
Non-Essential Amino Acids	Merck	M7145
Normocin	Aurogene	ant-nr-1
PBS buffer 1X	PanReac AppliChem	A0964,9050
Penicillin-streptomycin solution 100x	Euroclone	ECB3001D
Percoll	Santa Cruz	sc-296039A
Peristaltic pump	Ismatec™	MS-4/12 Reglo Digital Pump
TNFa	Peprotech	300-01A
TRI Reagent	Merck	T9424
Tubing	Ismatec™	ID.2,79mm
Williams' E Medium, no glutamine	Thermofisher Scientific	31415029
Y27632	Twin Helix	T1725