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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo apresenta uma técnica otimizada de perfusão hepática de colagenase em duas etapas em um modelo de rato e mostra o uso de hepatócitos isolados para cultura in vitro de longo prazo de organoides 3D.

Abstract

Os hepatócitos primários são uma ferramenta comumente usada para estudos in vitro relacionados ao fígado. No entanto, a manutenção dessas células sempre foi um desafio devido à rápida perda de morfologia, viabilidade e funcionalidade em cultura. Uma abordagem recente para a cultura de longo prazo é a geração de organoides tridimensionais (3D), uma ferramenta in vitro que pode recapitular tecidos em um prato com base na maravilhosa capacidade do fígado de se regenerar. Os protocolos publicados foram projetados para obter organoides 3D funcionais de longo prazo de hepatócitos adultos primários (Hep-Orgs). A ferramenta de ponta organoide 3D requer a capacidade de isolar células do tecido adulto, e esta etapa inicial é crucial para um resultado final de alta qualidade. A perfusão de colagenase em duas etapas, introduzida na década de 1970, ainda é um procedimento válido para a obtenção de hepatócitos únicos. O presente artigo tem como objetivo descrever todas as etapas cruciais do procedimento cirúrgico, otimizando assim o procedimento de isolamento de hepatócitos primários no modelo de rato. Além disso, é dada especial atenção às directrizes PREPARE para aumentar a probabilidade de procedimentos bem sucedidos e garantir resultados de elevada qualidade. Um protocolo detalhado permite que os pesquisadores acelerem e otimizem o trabalho a jusante para estabelecer organoides 3D a partir de hepatócitos primários de ratos adultos. Em comparação com os hepatócitos 2D, os Hep-Orgs ainda eram viáveis e em proliferação ativa no Dia 15, demonstrando um potencial de longo prazo.

Introduction

Os hepatócitos primários são uma ferramenta importante e amplamente utilizada para estudos in vitro relacionados ao fígado. No entanto, sua expansão e manutenção têm sido historicamente desafiadoras, pois perdem morfologia e funcionalidade após alguns dias na cultura1. A cultura 2D é uma condição limitante, em particular, para hepatócitos que possuem formato poligonal e estrutura polarizada com membranas apicais e basolaterais diferenciadas. De fato, a adesão dos hepatócitos à placa interfere em sua atividade normal, pois leva a um citoesqueleto plano com interação limitada entre as células e entre as ....

Protocol

Todos os procedimentos e alojamento dos animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes da Lei Italiana e da diretiva da Comunidade Europeia. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidados com os Animais local e pelo Ministério da Saúde italiano (licença n° 321/2022-PR) de acordo com o art.31 do decreto 26/2014.

1. Preparação para o procedimento animal

NOTA: Consulte a Tabela 1

Representative Results

Ao final dos procedimentos de montagem (etapa 6.13), obtivemos um rendimento celular de até 1 x 108 células por isolamento do fígado de cerca de 300 g de um rato. A viabilidade celular entre 78% e 97% foi estabelecida pela contagem de azul de tripano.

Como já descrito em estudos anteriores 1,18,19, os hepatócitos primários em cultura perdem sua morfol.......

Discussion

Os organoides 3D são uma fronteira para a medicina personalizada e permitem uma cultura de hepatócitos a longo prazo. A qualidade desta técnica inovadora requer um bom rendimento de hepatócitos primários viáveis e perfusão hepática e isolamento de hepatócitos bem executados. Este procedimento antigo ainda é amplamente utilizado; no entanto, compreende diferentes etapas que podem ser desafiadoras. Ao abordar o procedimento, experimentamos problemas críticos, como contaminação.......

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Davide Selvestrel e ao prof. Giovanni Sorrentino do SorrentinoLab da Universidade de Trieste por nos ajudar a realizar o ensaio de proliferação de EdU. O trabalho foi apoiado por uma bolsa ad hoc do Banca d'Italia e doações internas do FIF.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
A83-01- ALK5 Inhibitor IVTwin Helix T3031
B27Thermofisher Scientific0080085SA
CFX Connect Real-Time PCR Detection System  Bio-Rad
CHIR99021Twin HelixT2310
Click EdU Alexa 488 imaging kitThermofisher ScientificC10499
Collagen, Type I, solution from rat tailMerckC3867-1VL
Dexamethasone MerckD4902
EGFMerck E9644
Fetal bovine serum (FBS)EurocloneECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BMEThermofisher ScientificA1413202
Heparin Sodium 25000 IU/5 mlB. Braun Melsungen AGB01AB01
HGFPeprotech 100-39H 
Insulin-Transferrin-Selenium solution 100x Thermofisher Scientific41400045
L-Glutamine solutionEurocloneECB3000D
Liver Digest Medium Thermofisher Scientific 17703-034
Liver Perfusion MediumThermofisher Scientific17701038
N2 supplementThermofisher Scientific17502048
N-acetylcysteineMerckA9165
NicotinamideMerck N-0636
Non-Essential Amino AcidsMerckM7145
NormocinAurogeneant-nr-1
PBS buffer 1XPanReac AppliChemA0964,9050
Penicillin-streptomycin solution 100xEurocloneECB3001D
PercollSanta Cruzsc-296039A
Peristaltic pumpIsmatec™ MS-4/12 Reglo Digital Pump
TNFaPeprotech 300-01A
TRI ReagentMerckT9424
Tubing Ismatec™  ID.2,79mm
Williams' E Medium, no glutamineThermofisher Scientific31415029
Y27632Twin HelixT1725

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