Perfusão hepática de ratos e isolamento primário de hepatócitos: um procedimento antigo crucial para a cultura de organoides 3D de ponta

Summary

Este protocolo apresenta uma técnica otimizada de perfusão hepática de colagenase em duas etapas em um modelo de rato e mostra o uso de hepatócitos isolados para cultura in vitro de longo prazo de organoides 3D.

Abstract

Os hepatócitos primários são uma ferramenta comumente usada para estudos in vitro relacionados ao fígado. No entanto, a manutenção dessas células sempre foi um desafio devido à rápida perda de morfologia, viabilidade e funcionalidade em cultura. Uma abordagem recente para a cultura de longo prazo é a geração de organoides tridimensionais (3D), uma ferramenta in vitro que pode recapitular tecidos em um prato com base na maravilhosa capacidade do fígado de se regenerar. Os protocolos publicados foram projetados para obter organoides 3D funcionais de longo prazo de hepatócitos adultos primários (Hep-Orgs). A ferramenta de ponta organoide 3D requer a capacidade de isolar células do tecido adulto, e esta etapa inicial é crucial para um resultado final de alta qualidade. A perfusão de colagenase em duas etapas, introduzida na década de 1970, ainda é um procedimento válido para a obtenção de hepatócitos únicos. O presente artigo tem como objetivo descrever todas as etapas cruciais do procedimento cirúrgico, otimizando assim o procedimento de isolamento de hepatócitos primários no modelo de rato. Além disso, é dada especial atenção às directrizes PREPARE para aumentar a probabilidade de procedimentos bem sucedidos e garantir resultados de elevada qualidade. Um protocolo detalhado permite que os pesquisadores acelerem e otimizem o trabalho a jusante para estabelecer organoides 3D a partir de hepatócitos primários de ratos adultos. Em comparação com os hepatócitos 2D, os Hep-Orgs ainda eram viáveis e em proliferação ativa no Dia 15, demonstrando um potencial de longo prazo.

Introduction

Os hepatócitos primários são uma ferramenta importante e amplamente utilizada para estudos in vitro relacionados ao fígado. No entanto, sua expansão e manutenção têm sido historicamente desafiadoras, pois perdem morfologia e funcionalidade após alguns dias na cultura¹. A cultura 2D é uma condição limitante, em particular, para hepatócitos que possuem formato poligonal e estrutura polarizada com membranas apicais e basolaterais diferenciadas. De fato, a adesão dos hepatócitos à placa interfere em sua atividade normal, pois leva a um citoesqueleto plano com interação limitada entre as células e entre as ....

Protocol

Todos os procedimentos e alojamento dos animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes da Lei Italiana e da diretiva da Comunidade Europeia. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidados com os Animais local e pelo Ministério da Saúde italiano (licença n° 321/2022-PR) de acordo com o art.31 do decreto 26/2014.

1. Preparação para o procedimento animal

NOTA: Consulte a Tabela 1

Discussion

Os organoides 3D são uma fronteira para a medicina personalizada e permitem uma cultura de hepatócitos a longo prazo. A qualidade desta técnica inovadora requer um bom rendimento de hepatócitos primários viáveis e perfusão hepática e isolamento de hepatócitos bem executados. Este procedimento antigo ainda é amplamente utilizado; no entanto, compreende diferentes etapas que podem ser desafiadoras. Ao abordar o procedimento, experimentamos problemas críticos, como contaminação.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01- ALK5 Inhibitor IV	Twin Helix	T3031
B27	Thermofisher Scientific	0080085SA
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad
CHIR99021	Twin Helix	T2310
Click EdU Alexa 488 imaging kit	Thermofisher Scientific	C10499
Collagen, Type I, solution from rat tail	Merck	C3867-1VL
Dexamethasone	Merck	D4902
EGF	Merck	E9644
Fetal bovine serum (FBS)	Euroclone	ECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BME	Thermofisher Scientific	A1413202
Heparin Sodium 25000 IU/5 ml	B. Braun Melsungen AG	B01AB01
HGF	Peprotech	100-39H
Insulin-Transferrin-Selenium solution 100x	Thermofisher Scientific	41400045
L-Glutamine solution	Euroclone	ECB3000D
Liver Digest Medium	Thermofisher Scientific	17703-034
Liver Perfusion Medium	Thermofisher Scientific	17701038
N2 supplement	Thermofisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A9165
Nicotinamide	Merck	N-0636
Non-Essential Amino Acids	Merck	M7145
Normocin	Aurogene	ant-nr-1
PBS buffer 1X	PanReac AppliChem	A0964,9050
Penicillin-streptomycin solution 100x	Euroclone	ECB3001D
Percoll	Santa Cruz	sc-296039A
Peristaltic pump	Ismatec™	MS-4/12 Reglo Digital Pump
TNFa	Peprotech	300-01A
TRI Reagent	Merck	T9424
Tubing	Ismatec™	ID.2,79mm
Williams' E Medium, no glutamine	Thermofisher Scientific	31415029
Y27632	Twin Helix	T1725