Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В этом протоколе представлен оптимизированный двухэтапный метод перфузии печени коллагеназой на модели крысы и показано использование выделенных гепатоцитов для долгосрочного культивирования 3D-органоидов in vitro .

Abstract

Первичные гепатоциты являются широко используемым инструментом для исследований печени in vitro . Тем не менее, поддержание этих клеток всегда было проблемой из-за быстрой потери морфологии, жизнеспособности и функциональности в культуре. Недавний подход к долгосрочному культивированию заключается в создании трехмерных (3D) органоидов, инструмента in vitro , который может восстанавливать ткани в чашке, основываясь на удивительной способности печени к саморегенерации. Опубликованные протоколы были разработаны для получения долговременных функциональных 3D-органоидов из первичных взрослых гепатоцитов (Hep-Orgs). Передовой инструмент для 3D-органоидов требует возможности выделять клетки из тканей взрослого человека, и этот начальный шаг имеет решающее значение для получения высококачественного конечного результата. Двухступенчатая перфузия коллагеназы, введенная в 1970-х годах, до сих пор является действующей процедурой для получения одиночных гепатоцитов. Цель настоящей статьи – описать все важнейшие этапы хирургической процедуры, тем самым оптимизировав процедуру выделения первичных гепатоцитов на модели крысы. Более того, особое внимание уделяется рекомендациям PREPARE для повышения вероятности успешных процедур и обеспечения высококачественных результатов. Подробный протокол позволяет исследователям ускорить и оптимизировать последующую работу по созданию трехмерных органоидов из первичных гепатоцитов взрослых крыс. По сравнению с двумерными гепатоцитами, геп-орги все еще были жизнеспособны и находились в активной пролиферации на 15-й день, демонстрируя долгосрочный потенциал.

Introduction

Первичные гепатоциты являются важным и широко используемым инструментом для исследований печени in vitro . Тем не менее, их расширение и поддержание исторически были сложными, так как они теряют морфологию и функциональность после нескольких дней в культуре1. 2D культура является лимитирующим условием, в частности, для гепатоцитов, имеющих многоугольную форму и поляризованную структуру с дифференцированными апикальными и базолатеральными мембранами. Фактически, адгезия гепатоцитов к пластине нарушает их нормальную активность, поскольку приводит к образованию плоского цитоскелета с ограниченным взаимоде....

Protocol

Все процедуры и содержание животных проводились в соответствии с руководящими принципами итальянского законодательства и директивой Европейского Сообщества. Протокол эксперимента был одобрен местным Комитетом по уходу за животными и Министерством здравоохранени.......

Representative Results

В конце процедур настройки (шаг 6.13) мы получили выход клеток до 1 x 108 клеток на выделение из печени около 300 г крысы. Жизнеспособность клеток в диапазоне от 78% до 97% была установлена с помощью подсчета трипанового синего цвета.

Как уже было описано в п?.......

Discussion

3D-органоиды являются рубежом для персонализированной медицины и позволяют проводить долгосрочное культивирование гепатоцитов. Качество этой инновационной методики требует хорошего выхода жизнеспособных первичных гепатоцитов и хорошо выполненной перфузии печени.......

Acknowledgements

Мы благодарим доктора Давиде Селвестрель и профессора Джованни Соррентино из SorrentinoLab Университета Триеста за помощь в проведении анализа пролиферации EdU. Работа была поддержана специальным грантом Banca d'Italia и внутренними грантами FIF.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
A83-01- ALK5 Inhibitor IVTwin Helix T3031
B27Thermofisher Scientific0080085SA
CFX Connect Real-Time PCR Detection System  Bio-Rad
CHIR99021Twin HelixT2310
Click EdU Alexa 488 imaging kitThermofisher ScientificC10499
Collagen, Type I, solution from rat tailMerckC3867-1VL
Dexamethasone MerckD4902
EGFMerck E9644
Fetal bovine serum (FBS)EurocloneECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BMEThermofisher ScientificA1413202
Heparin Sodium 25000 IU/5 mlB. Braun Melsungen AGB01AB01
HGFPeprotech 100-39H 
Insulin-Transferrin-Selenium solution 100x Thermofisher Scientific41400045
L-Glutamine solutionEurocloneECB3000D
Liver Digest Medium Thermofisher Scientific 17703-034
Liver Perfusion MediumThermofisher Scientific17701038
N2 supplementThermofisher Scientific17502048
N-acetylcysteineMerckA9165
NicotinamideMerck N-0636
Non-Essential Amino AcidsMerckM7145
NormocinAurogeneant-nr-1
PBS buffer 1XPanReac AppliChemA0964,9050
Penicillin-streptomycin solution 100xEurocloneECB3001D
PercollSanta Cruzsc-296039A
Peristaltic pumpIsmatec™ MS-4/12 Reglo Digital Pump
TNFaPeprotech 300-01A
TRI ReagentMerckT9424
Tubing Ismatec™  ID.2,79mm
Williams' E Medium, no glutamineThermofisher Scientific31415029
Y27632Twin HelixT1725

References

Explore More Articles

213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved