Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В этом протоколе представлен оптимизированный двухэтапный метод перфузии печени коллагеназой на модели крысы и показано использование выделенных гепатоцитов для долгосрочного культивирования 3D-органоидов in vitro .

Abstract

Первичные гепатоциты являются широко используемым инструментом для исследований печени in vitro . Тем не менее, поддержание этих клеток всегда было проблемой из-за быстрой потери морфологии, жизнеспособности и функциональности в культуре. Недавний подход к долгосрочному культивированию заключается в создании трехмерных (3D) органоидов, инструмента in vitro , который может восстанавливать ткани в чашке, основываясь на удивительной способности печени к саморегенерации. Опубликованные протоколы были разработаны для получения долговременных функциональных 3D-органоидов из первичных взрослых гепатоцитов (Hep-Orgs). Передовой инструмент для 3D-органоидов требует возможности выделять клетки из тканей взрослого человека, и этот начальный шаг имеет решающее значение для получения высококачественного конечного результата. Двухступенчатая перфузия коллагеназы, введенная в 1970-х годах, до сих пор является действующей процедурой для получения одиночных гепатоцитов. Цель настоящей статьи – описать все важнейшие этапы хирургической процедуры, тем самым оптимизировав процедуру выделения первичных гепатоцитов на модели крысы. Более того, особое внимание уделяется рекомендациям PREPARE для повышения вероятности успешных процедур и обеспечения высококачественных результатов. Подробный протокол позволяет исследователям ускорить и оптимизировать последующую работу по созданию трехмерных органоидов из первичных гепатоцитов взрослых крыс. По сравнению с двумерными гепатоцитами, геп-орги все еще были жизнеспособны и находились в активной пролиферации на 15-й день, демонстрируя долгосрочный потенциал.

Introduction

Первичные гепатоциты являются важным и широко используемым инструментом для исследований печени in vitro . Тем не менее, их расширение и поддержание исторически были сложными, так как они теряют морфологию и функциональность после нескольких дней в культуре1. 2D культура является лимитирующим условием, в частности, для гепатоцитов, имеющих многоугольную форму и поляризованную структуру с дифференцированными апикальными и базолатеральными мембранами. Фактически, адгезия гепатоцитов к пластине нарушает их нормальную активность, поскольку приводит к образованию плоского цитоскелета с ограниченным взаимоде....

Protocol

Все процедуры и содержание животных проводились в соответствии с руководящими принципами итальянского законодательства и директивой Европейского Сообщества. Протокол эксперимента был одобрен местным Комитетом по уходу за животными и Министерством здравоохранени.......

Representative Results

В конце процедур настройки (шаг 6.13) мы получили выход клеток до 1 x 108 клеток на выделение из печени около 300 г крысы. Жизнеспособность клеток в диапазоне от 78% до 97% была установлена с помощью подсчета трипанового синего цвета.

Как уже было описано в п?.......

Discussion

3D-органоиды являются рубежом для персонализированной медицины и позволяют проводить долгосрочное культивирование гепатоцитов. Качество этой инновационной методики требует хорошего выхода жизнеспособных первичных гепатоцитов и хорошо выполненной перфузии печени.......

Disclosures

Все авторы раскрыли все конфликты интересов.

Acknowledgements

Мы благодарим доктора Давиде Селвестрель и профессора Джованни Соррентино из SorrentinoLab Университета Триеста за помощь в проведении анализа пролиферации EdU. Работа была поддержана специальным грантом Banca d'Italia и внутренними грантами FIF.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
A83-01- ALK5 Inhibitor IVTwin Helix T3031
B27Thermofisher Scientific0080085SA
CFX Connect Real-Time PCR Detection System  Bio-Rad
CHIR99021Twin HelixT2310
Click EdU Alexa 488 imaging kitThermofisher ScientificC10499
Collagen, Type I, solution from rat tailMerckC3867-1VL
Dexamethasone MerckD4902
EGFMerck E9644
Fetal bovine serum (FBS)EurocloneECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BMEThermofisher ScientificA1413202
Heparin Sodium 25000 IU/5 mlB. Braun Melsungen AGB01AB01
HGFPeprotech 100-39H 
Insulin-Transferrin-Selenium solution 100x Thermofisher Scientific41400045
L-Glutamine solutionEurocloneECB3000D
Liver Digest Medium Thermofisher Scientific 17703-034
Liver Perfusion MediumThermofisher Scientific17701038
N2 supplementThermofisher Scientific17502048
N-acetylcysteineMerckA9165
NicotinamideMerck N-0636
Non-Essential Amino AcidsMerckM7145
NormocinAurogeneant-nr-1
PBS buffer 1XPanReac AppliChemA0964,9050
Penicillin-streptomycin solution 100xEurocloneECB3001D
PercollSanta Cruzsc-296039A
Peristaltic pumpIsmatec™ MS-4/12 Reglo Digital Pump
TNFaPeprotech 300-01A
TRI ReagentMerckT9424
Tubing Ismatec™  ID.2,79mm
Williams' E Medium, no glutamineThermofisher Scientific31415029
Y27632Twin HelixT1725

References

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved