A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
В этом протоколе представлен оптимизированный двухэтапный метод перфузии печени коллагеназой на модели крысы и показано использование выделенных гепатоцитов для долгосрочного культивирования 3D-органоидов in vitro .
Первичные гепатоциты являются широко используемым инструментом для исследований печени in vitro . Тем не менее, поддержание этих клеток всегда было проблемой из-за быстрой потери морфологии, жизнеспособности и функциональности в культуре. Недавний подход к долгосрочному культивированию заключается в создании трехмерных (3D) органоидов, инструмента in vitro , который может восстанавливать ткани в чашке, основываясь на удивительной способности печени к саморегенерации. Опубликованные протоколы были разработаны для получения долговременных функциональных 3D-органоидов из первичных взрослых гепатоцитов (Hep-Orgs). Передовой инструмент для 3D-органоидов требует возможности выделять клетки из тканей взрослого человека, и этот начальный шаг имеет решающее значение для получения высококачественного конечного результата. Двухступенчатая перфузия коллагеназы, введенная в 1970-х годах, до сих пор является действующей процедурой для получения одиночных гепатоцитов. Цель настоящей статьи – описать все важнейшие этапы хирургической процедуры, тем самым оптимизировав процедуру выделения первичных гепатоцитов на модели крысы. Более того, особое внимание уделяется рекомендациям PREPARE для повышения вероятности успешных процедур и обеспечения высококачественных результатов. Подробный протокол позволяет исследователям ускорить и оптимизировать последующую работу по созданию трехмерных органоидов из первичных гепатоцитов взрослых крыс. По сравнению с двумерными гепатоцитами, геп-орги все еще были жизнеспособны и находились в активной пролиферации на 15-й день, демонстрируя долгосрочный потенциал.
Первичные гепатоциты являются важным и широко используемым инструментом для исследований печени in vitro . Тем не менее, их расширение и поддержание исторически были сложными, так как они теряют морфологию и функциональность после нескольких дней в культуре1. 2D культура является лимитирующим условием, в частности, для гепатоцитов, имеющих многоугольную форму и поляризованную структуру с дифференцированными апикальными и базолатеральными мембранами. Фактически, адгезия гепатоцитов к пластине нарушает их нормальную активность, поскольку приводит к образованию плоского цитоскелета с ограниченным взаимоде....
Все процедуры и содержание животных проводились в соответствии с руководящими принципами итальянского законодательства и директивой Европейского Сообщества. Протокол эксперимента был одобрен местным Комитетом по уходу за животными и Министерством здравоохранени.......
В конце процедур настройки (шаг 6.13) мы получили выход клеток до 1 x 108 клеток на выделение из печени около 300 г крысы. Жизнеспособность клеток в диапазоне от 78% до 97% была установлена с помощью подсчета трипанового синего цвета.
Как уже было описано в п?.......
3D-органоиды являются рубежом для персонализированной медицины и позволяют проводить долгосрочное культивирование гепатоцитов. Качество этой инновационной методики требует хорошего выхода жизнеспособных первичных гепатоцитов и хорошо выполненной перфузии печени.......
Мы благодарим доктора Давиде Селвестрель и профессора Джованни Соррентино из SorrentinoLab Университета Триеста за помощь в проведении анализа пролиферации EdU. Работа была поддержана специальным грантом Banca d'Italia и внутренними грантами FIF.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
A83-01- ALK5 Inhibitor IV | Twin Helix | T3031 | |
B27 | Thermofisher Scientific | 0080085SA | |
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
CHIR99021 | Twin Helix | T2310 | |
Click EdU Alexa 488 imaging kit | Thermofisher Scientific | C10499 | |
Collagen, Type I, solution from rat tail | Merck | C3867-1VL | |
Dexamethasone | Merck | D4902 | |
EGF | Merck | E9644 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Euroclone | ECS0180L | |
GELTREX LDEV FREE RGF BME | Thermofisher Scientific | A1413202 | |
Heparin Sodium 25000 IU/5 ml | B. Braun Melsungen AG | B01AB01 | |
HGF | Peprotech | 100-39H | |
Insulin-Transferrin-Selenium solution 100x | Thermofisher Scientific | 41400045 | |
L-Glutamine solution | Euroclone | ECB3000D | |
Liver Digest Medium | Thermofisher Scientific | 17703-034 | |
Liver Perfusion Medium | Thermofisher Scientific | 17701038 | |
N2 supplement | Thermofisher Scientific | 17502048 | |
N-acetylcysteine | Merck | A9165 | |
Nicotinamide | Merck | N-0636 | |
Non-Essential Amino Acids | Merck | M7145 | |
Normocin | Aurogene | ant-nr-1 | |
PBS buffer 1X | PanReac AppliChem | A0964,9050 | |
Penicillin-streptomycin solution 100x | Euroclone | ECB3001D | |
Percoll | Santa Cruz | sc-296039A | |
Peristaltic pump | Ismatec™ | MS-4/12 Reglo Digital Pump | |
TNFa | Peprotech | 300-01A | |
TRI Reagent | Merck | T9424 | |
Tubing | Ismatec™ | ID.2,79mm | |
Williams' E Medium, no glutamine | Thermofisher Scientific | 31415029 | |
Y27632 | Twin Helix | T1725 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved