Перфузия печени крыс и выделение первичных гепатоцитов: старая процедура, имеющая решающее значение для создания передовых 3D-органоидов

Summary

В этом протоколе представлен оптимизированный двухэтапный метод перфузии печени коллагеназой на модели крысы и показано использование выделенных гепатоцитов для долгосрочного культивирования 3D-органоидов in vitro .

Abstract

Первичные гепатоциты являются широко используемым инструментом для исследований печени in vitro . Тем не менее, поддержание этих клеток всегда было проблемой из-за быстрой потери морфологии, жизнеспособности и функциональности в культуре. Недавний подход к долгосрочному культивированию заключается в создании трехмерных (3D) органоидов, инструмента in vitro , который может восстанавливать ткани в чашке, основываясь на удивительной способности печени к саморегенерации. Опубликованные протоколы были разработаны для получения долговременных функциональных 3D-органоидов из первичных взрослых гепатоцитов (Hep-Orgs). Передовой инструмент для 3D-органоидов требует возможности выделять клетки из тканей взрослого человека, и этот начальный шаг имеет решающее значение для получения высококачественного конечного результата. Двухступенчатая перфузия коллагеназы, введенная в 1970-х годах, до сих пор является действующей процедурой для получения одиночных гепатоцитов. Цель настоящей статьи – описать все важнейшие этапы хирургической процедуры, тем самым оптимизировав процедуру выделения первичных гепатоцитов на модели крысы. Более того, особое внимание уделяется рекомендациям PREPARE для повышения вероятности успешных процедур и обеспечения высококачественных результатов. Подробный протокол позволяет исследователям ускорить и оптимизировать последующую работу по созданию трехмерных органоидов из первичных гепатоцитов взрослых крыс. По сравнению с двумерными гепатоцитами, геп-орги все еще были жизнеспособны и находились в активной пролиферации на 15-й день, демонстрируя долгосрочный потенциал.

Introduction

Первичные гепатоциты являются важным и широко используемым инструментом для исследований печени in vitro . Тем не менее, их расширение и поддержание исторически были сложными, так как они теряют морфологию и функциональность после нескольких дней в культуре¹. 2D культура является лимитирующим условием, в частности, для гепатоцитов, имеющих многоугольную форму и поляризованную структуру с дифференцированными апикальными и базолатеральными мембранами. Фактически, адгезия гепатоцитов к пластине нарушает их нормальную активность, поскольку приводит к образованию плоского цитоскелета с ограниченным взаимоде....

Protocol

Все процедуры и содержание животных проводились в соответствии с руководящими принципами итальянского законодательства и директивой Европейского Сообщества. Протокол эксперимента был одобрен местным Комитетом по уходу за животными и Министерством здравоохранени.......

Discussion

3D-органоиды являются рубежом для персонализированной медицины и позволяют проводить долгосрочное культивирование гепатоцитов. Качество этой инновационной методики требует хорошего выхода жизнеспособных первичных гепатоцитов и хорошо выполненной перфузии печени.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01- ALK5 Inhibitor IV	Twin Helix	T3031
B27	Thermofisher Scientific	0080085SA
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad
CHIR99021	Twin Helix	T2310
Click EdU Alexa 488 imaging kit	Thermofisher Scientific	C10499
Collagen, Type I, solution from rat tail	Merck	C3867-1VL
Dexamethasone	Merck	D4902
EGF	Merck	E9644
Fetal bovine serum (FBS)	Euroclone	ECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BME	Thermofisher Scientific	A1413202
Heparin Sodium 25000 IU/5 ml	B. Braun Melsungen AG	B01AB01
HGF	Peprotech	100-39H
Insulin-Transferrin-Selenium solution 100x	Thermofisher Scientific	41400045
L-Glutamine solution	Euroclone	ECB3000D
Liver Digest Medium	Thermofisher Scientific	17703-034
Liver Perfusion Medium	Thermofisher Scientific	17701038
N2 supplement	Thermofisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A9165
Nicotinamide	Merck	N-0636
Non-Essential Amino Acids	Merck	M7145
Normocin	Aurogene	ant-nr-1
PBS buffer 1X	PanReac AppliChem	A0964,9050
Penicillin-streptomycin solution 100x	Euroclone	ECB3001D
Percoll	Santa Cruz	sc-296039A
Peristaltic pump	Ismatec™	MS-4/12 Reglo Digital Pump
TNFa	Peprotech	300-01A
TRI Reagent	Merck	T9424
Tubing	Ismatec™	ID.2,79mm
Williams' E Medium, no glutamine	Thermofisher Scientific	31415029
Y27632	Twin Helix	T1725