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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

本文建立了用于单细胞和细胞核测序的高质量原肠胚单细胞和细胞核悬液的管道。

Abstract

在过去十年中,单细胞方法已成为研究样本中基因表达动力学、细胞异质性和细胞状态的金标准。在单细胞发展之前,在早期发育过程中捕捉动态细胞景观和快速细胞转变的可行性是有限的。在本文中,设计了一个强大的管道,用于对从胚胎第 E6.5 天到 E8 的小鼠胚胎进行单细胞和细胞核分析,对应于原肠胚形成的开始和完成。原肠胚形成是发育过程中的一个基本过程,它建立了三个生发层:中胚层、外胚层和内胚层,它们对器官发生至关重要。关于应用于野生型腹膜胚胎的单细胞组学的大量文献。然而,突变胚胎的单细胞分析仍然很少,并且通常仅限于 FACS 分选的群体。这部分是由于与基因分型需求、定时怀孕、每次怀孕具有所需基因型的胚胎数量以及这些阶段每个胚胎的细胞数量相关的技术限制。在这里,提出了一种旨在克服这些限制的方法。这种方法建立了育种和定时怀孕指南,以实现与所需基因型同步怀孕的更高机会。胚胎分离过程中的优化步骤与当天基因分型方案 (3 h) 相结合,允许在同一天进行基于微滴的单细胞检测,确保细胞的高活力和可靠的结果。该方法还包括从胚胎中最佳细胞核分离的指南。因此,这些方法增加了原肠胚形成阶段突变胚胎单细胞方法的可行性。我们预计这种方法将有助于分析突变如何塑造原肠胚的细胞景观。

Introduction

胃肠胚形成是正常发育所需的基本过程。当多能细胞转变为定义器官形成方式的谱系特异性前体时,就会发生这种快速而动态的过程。多年来,原肠胚形成长期以来被定义为三个基本同质的群体的形成:中胚层、外胚层和内胚层。然而,高分辨率技术和大量新兴的胚胎干细胞模型 1,2 揭示了早期胚层之间前所未有的异质性 3,4这表明关于调节原肠不同细胞群的机制还有更多有待揭示。小鼠胚胎发育一直是研究原肠胚形成过程中早期细胞命运决策的最佳模型之一 3,5。小鼠的原肠胚形成是迅速的,因为原肠胚形成的整个过程发生在 48 小时内,从胚胎第 E6.5 天到 E85

单细胞技术的最新进展使野生型小鼠胚胎发育的详细图谱成为可能,提供了原肠胚形成过程中胚胎细胞和分子景观的全面概述 3,4,6,7,8

Protocol

该协议和所描述的所有动物实验均已正式批准,并符合天普大学机构动物护理和使用委员会制定的机构指南,该委员会遵循实验动物护理评估和认证协会国际指南。所有描述的小鼠均在 C57/BL6N 背景菌株上。在这些研究中未观察到动物健康问题。

1. 繁殖群和定时怀孕

  1. 通过阴道栓的可视化来安排怀孕时间。插头当天的中午被认为是 E0.5。
  2. 笼子里的家?.......

Representative Results

本文设计的方法专门用于增强 E6.5 至 E8 单细胞组学胚胎样品的制备。这个强大的管道包括五个主要步骤:同步定时怀孕、胚胎分离、当天基因分型、细胞解离和细胞活力评估(图 1A)。虽然提供的数据侧重于从 E7 到 E7.5 的时间点,但它可以应用于高达 E8 的胚胎(图 1B),程序变化很小(请参阅整个协议中的注释)。通过将两只雌性小鼠与一只雄性小?.......

Discussion

本文提出了一种从原肠胚中获得高质量单细胞和细胞核悬浮液的稳健管道,专门用于促进早期发育中细胞命运规范机制的研究。该方法通过优化需要基因型(例如性别或体细胞基因)的胚胎的分析,解决了原肠胚形成领域的关键空白。通过利用基因突变小鼠模型并在全小鼠胚胎上采用高分辨率单细胞测序,该管道可以进一步增强对早期小鼠原肠菌基因表达谱的理解。该方法证明了通过 Cre 重组酶?.......

Acknowledgements

我们感谢 Fox Chase 癌症中心的基因组学核心以及 Johnathan Whetstine 博士实验室成员 Zach Gray、Madison Honer 和 Benjamin Ferman 为测序实验提供的技术支持。我们感谢 Estaras 博士和 Alex Morris 的实验室成员,他们是一名轮换研究生,为单细胞研究的初步分析做出了贡献。这项工作由 NIH 赠款 R01HD106969 和 R56HL163146 Conchi Estaras 资助。此外,Elizabeth Abraham 还获得了 T32 培训补助金 5T32HL091804-12 的支持。

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm Petri dishGenesee Scientific25-202
1000 µL Reach Barrier TipGenesee Scientific23-430
20 µL Reach Barrier TipGenesee Scientific24-404
300 µL Reach Barrier TipGenesee Scientific24-415
37 µm Reversible Strainer, smallStem Cell27215
6 cm Petri dishGenesee Scientific25-260
8-strip PCR tubesGenesee Scientific27-125U
AgaroseApex Bioresearch Product20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry BathGenesee31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated MicrocentrifugeGenesee33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153
Chromium Controller10XPN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.110XPN-1000269
Countess 3 Automated Cell CounterInvitrogenAMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber SlidesInvitrogenC10283
D1000 ReagentsAgilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
DigitoninThermoFisher ScientificBN2006
DirectPCR yolk sacViagen201-Y
Dithiothreitol (DTT)ThermoFisher ScientificR0861
DNA LoBind Tube 1.5 mLEppendorf22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)CORNING10-013-CV
Dulbecco's PBSGenClone25-508
Dumont #5 Fine ForcepsFine Science Tools11254-20
Dumont #5SF ForcepsFine Science Tools11252-00
EthanolKoptecV1401
EVOS M7000 Imaging SystemInvitrogenAMF7000
Fine Scissors - SharpFine Science Tools14060-11
GoTaq G2 Green Master MixPromegaM7823
Graefe ForcepsFine Science Tools11049-10
MgCl2ThermoFisher ScientificAC223211000
MiniAmp Thermal CyclerApplied BiosystemsA37834
NaClFisher ChemicalS271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3Illumina20046811
NextSeq2000Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo MicroscopeNikon
Nondiedt P40Sigma-Aldrich74385
Nuclease-free WaterGenClone25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)Agilent401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)Agilent401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/UnitGenesee31-511
Proteinase KSigma-AldrichP6556
Qubit dsDNA Quantification Assay KitsInvitrogenQ32851
Qubit Flex 3Invitrogen
RNase inhibitorFisher Scientific12-141-368
Standard Pattern ForcepsFine Science Tools11000-12
Tape Station Loading tipsAgilent5067-5598
Tapestation 4150AgilentG2992AA
Tris-HCL (Ph7)Quality Biological351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%Theromo Fisher ScientificT10282
Tryple ExpressGibco12604-021
Tween-20Bio-Rad1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapterIKA3617000

References

  1. Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering. Dev Biol. 488, 35-46 (2022).
  2. Kim, Y., Kim, I., Shin, K.

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