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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Questo articolo stabilisce una pipeline per sospensioni di singole cellule e nuclei di alta qualità di embrioni di topo gastrulanti per il sequenziamento di singole cellule e nuclei.

Abstract

Nell'ultimo decennio, gli approcci a singola cellula sono diventati il gold standard per lo studio della dinamica dell'espressione genica, dell'eterogeneità cellulare e degli stati cellulari all'interno dei campioni. Prima dell'avanzamento delle singole cellule, la possibilità di catturare il panorama cellulare dinamico e le rapide transizioni cellulari durante lo sviluppo iniziale era limitata. In questo articolo, è stata progettata una robusta pipeline per eseguire analisi di singole cellule e nuclei su embrioni di topo dal giorno embrionale E6.5 a E8, corrispondente all'inizio e al completamento della gastrulazione. La gastrulazione è un processo fondamentale durante lo sviluppo che stabilisce i tre strati germinali: mesoderma, ectoderma ed endoderma, che sono essenziali per l'organogenesi. È disponibile un'ampia letteratura sulle omiche a singola cellula applicate agli embrioni perigastrulanti wild-type. Tuttavia, l'analisi di embrioni mutanti su singole cellule è ancora scarsa e spesso limitata alle popolazioni selezionate con FACS. Ciò è in parte dovuto ai vincoli tecnici associati alla necessità di genotipizzazione, alle gravidanze programmate, al numero di embrioni con genotipi desiderati per gravidanza e al numero di cellule per embrione in queste fasi. Qui viene presentata una metodologia progettata per superare questi limiti. Questo metodo stabilisce linee guida per l'allevamento e la gravidanza a tempo per ottenere una maggiore possibilità di gravidanze sincronizzate con i genotipi desiderati. Le fasi di ottimizzazione del processo di isolamento dell'embrione, abbinate a un protocollo di genotipizzazione in giornata (3 ore), consentono di eseguire una singola cellula basata su microgoccioline nello stesso giorno, garantendo un'elevata vitalità delle cellule e risultati robusti. Questo metodo include inoltre linee guida per l'isolamento ottimale dei nuclei dagli embrioni. Pertanto, questi approcci aumentano la fattibilità di approcci a singola cellula di embrioni mutanti nella fase di gastrulazione. Prevediamo che questo metodo faciliterà l'analisi di come le mutazioni modellano il paesaggio cellulare della gastrula.

Introduction

La gastrulazione è un processo fondamentale necessario per il normale sviluppo. Questo processo rapido e dinamico si verifica quando le cellule pluripotenti si trasformano in precursori specifici del lignaggio che definiscono il modo in cui si formano gli organi. Per anni, la gastrulazione è stata a lungo definita come la formazione di tre popolazioni in gran parte omogenee: mesoderma, ectoderma ed endoderma. Tuttavia, le tecnologie ad alta risoluzione e un numero emergente di modelli di cellule staminali embrionali 1,2 rivelano un'eterogeneità senza precedenti tra gli strati germinali precoci 3,4

Protocol

Questo protocollo e tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati formalmente approvati e in conformità con le linee guida istituzionali stabilite dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Temple University, che segue le linee guida internazionali dell'Associazione per la Valutazione e l'Accreditamento della Cura degli Animali da Laboratorio. Tutti i topi descritti erano sul ceppo di fondo C57/BL6N. In questi studi non sono stati osservati problemi di salute animale.

Representative Results

La metodologia progettata in questo articolo è specificamente destinata a migliorare la preparazione di campioni di embrioni per l'omica a singola cellula da E6.5 a E8. Questa solida pipeline è composta da cinque fasi principali: gravidanze sincronizzate a tempo, isolamento degli embrioni, genotipizzazione in giornata, dissociazione cellulare e valutazione della vitalità cellulare (Figura 1A). Mentre i dati presentati si concentrano su punti temporali da E7 a E7.5, possono essere applicat.......

Discussion

In questo articolo viene presentata una robusta pipeline per ottenere sospensioni di singole cellule e nuclei di alta qualità da embrioni di topo gastrulanti, specificamente progettata per facilitare gli studi sui meccanismi di specificazione del destino cellulare nelle prime fasi di sviluppo. Questo metodo affronta una lacuna cruciale nel campo della gastrulazione ottimizzando l'analisi degli embrioni che richiedono genotipi, come il sesso o i geni somatici. Utilizzando modelli murini di mutazione genetica e impiegando.......

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

Ringraziamo il Genomics Core del Fox Chase Cancer Center e i membri del laboratorio del Dr. Johnathan Whetstine Zach Gray, Madison Honer e Benjamin Ferman per il supporto tecnico per gli esperimenti di sequenziamento. Ringraziamo i membri del laboratorio del Dr. Estaras e Alex Morris, uno studente laureato a rotazione che ha contribuito all'analisi iniziale degli studi su singole cellule. Questo lavoro è finanziato dalle sovvenzioni NIH R01HD106969 e R56HL163146 a Conchi Estaras. Inoltre, Elizabeth Abraham è stata supportata dalla sovvenzione di formazione T32 5T32HL091804-12.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm Petri dishGenesee Scientific25-202
1000 µL Reach Barrier TipGenesee Scientific23-430
20 µL Reach Barrier TipGenesee Scientific24-404
300 µL Reach Barrier TipGenesee Scientific24-415
37 µm Reversible Strainer, smallStem Cell27215
6 cm Petri dishGenesee Scientific25-260
8-strip PCR tubesGenesee Scientific27-125U
AgaroseApex Bioresearch Product20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry BathGenesee31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated MicrocentrifugeGenesee33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153
Chromium Controller10XPN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.110XPN-1000269
Countess 3 Automated Cell CounterInvitrogenAMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber SlidesInvitrogenC10283
D1000 ReagentsAgilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
DigitoninThermoFisher ScientificBN2006
DirectPCR yolk sacViagen201-Y
Dithiothreitol (DTT)ThermoFisher ScientificR0861
DNA LoBind Tube 1.5 mLEppendorf22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)CORNING10-013-CV
Dulbecco's PBSGenClone25-508
Dumont #5 Fine ForcepsFine Science Tools11254-20
Dumont #5SF ForcepsFine Science Tools11252-00
EthanolKoptecV1401
EVOS M7000 Imaging SystemInvitrogenAMF7000
Fine Scissors - SharpFine Science Tools14060-11
GoTaq G2 Green Master MixPromegaM7823
Graefe ForcepsFine Science Tools11049-10
MgCl2ThermoFisher ScientificAC223211000
MiniAmp Thermal CyclerApplied BiosystemsA37834
NaClFisher ChemicalS271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3Illumina20046811
NextSeq2000Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo MicroscopeNikon
Nondiedt P40Sigma-Aldrich74385
Nuclease-free WaterGenClone25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)Agilent401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)Agilent401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/UnitGenesee31-511
Proteinase KSigma-AldrichP6556
Qubit dsDNA Quantification Assay KitsInvitrogenQ32851
Qubit Flex 3Invitrogen
RNase inhibitorFisher Scientific12-141-368
Standard Pattern ForcepsFine Science Tools11000-12
Tape Station Loading tipsAgilent5067-5598
Tapestation 4150AgilentG2992AA
Tris-HCL (Ph7)Quality Biological351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%Theromo Fisher ScientificT10282
Tryple ExpressGibco12604-021
Tween-20Bio-Rad1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapterIKA3617000

References

  1. Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering. Dev Biol. 488, 35-46 (2022).
  2. Kim, Y., Kim, I., Shin, K.

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Parole chiave Sequenziamento dell RNA a singola cellulaEmbrioni di topoGastrulazioneEterogeneit cellulareStati cellulariStrati germinaliMesodermaEctodermaEndodermaEmbrioni mutantiPopolazioni selezionate FACSGravidanze a tempoGenotipizzazioneIsolamento dei nuclei

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