Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione

Summary

Questo articolo stabilisce una pipeline per sospensioni di singole cellule e nuclei di alta qualità di embrioni di topo gastrulanti per il sequenziamento di singole cellule e nuclei.

Abstract

Nell'ultimo decennio, gli approcci a singola cellula sono diventati il gold standard per lo studio della dinamica dell'espressione genica, dell'eterogeneità cellulare e degli stati cellulari all'interno dei campioni. Prima dell'avanzamento delle singole cellule, la possibilità di catturare il panorama cellulare dinamico e le rapide transizioni cellulari durante lo sviluppo iniziale era limitata. In questo articolo, è stata progettata una robusta pipeline per eseguire analisi di singole cellule e nuclei su embrioni di topo dal giorno embrionale E6.5 a E8, corrispondente all'inizio e al completamento della gastrulazione. La gastrulazione è un processo fondamentale durante lo sviluppo che stabilisce i tre strati germinali: mesoderma, ectoderma ed endoderma, che sono essenziali per l'organogenesi. È disponibile un'ampia letteratura sulle omiche a singola cellula applicate agli embrioni perigastrulanti wild-type. Tuttavia, l'analisi di embrioni mutanti su singole cellule è ancora scarsa e spesso limitata alle popolazioni selezionate con FACS. Ciò è in parte dovuto ai vincoli tecnici associati alla necessità di genotipizzazione, alle gravidanze programmate, al numero di embrioni con genotipi desiderati per gravidanza e al numero di cellule per embrione in queste fasi. Qui viene presentata una metodologia progettata per superare questi limiti. Questo metodo stabilisce linee guida per l'allevamento e la gravidanza a tempo per ottenere una maggiore possibilità di gravidanze sincronizzate con i genotipi desiderati. Le fasi di ottimizzazione del processo di isolamento dell'embrione, abbinate a un protocollo di genotipizzazione in giornata (3 ore), consentono di eseguire una singola cellula basata su microgoccioline nello stesso giorno, garantendo un'elevata vitalità delle cellule e risultati robusti. Questo metodo include inoltre linee guida per l'isolamento ottimale dei nuclei dagli embrioni. Pertanto, questi approcci aumentano la fattibilità di approcci a singola cellula di embrioni mutanti nella fase di gastrulazione. Prevediamo che questo metodo faciliterà l'analisi di come le mutazioni modellano il paesaggio cellulare della gastrula.

Introduction

La gastrulazione è un processo fondamentale necessario per il normale sviluppo. Questo processo rapido e dinamico si verifica quando le cellule pluripotenti si trasformano in precursori specifici del lignaggio che definiscono il modo in cui si formano gli organi. Per anni, la gastrulazione è stata a lungo definita come la formazione di tre popolazioni in gran parte omogenee: mesoderma, ectoderma ed endoderma. Tuttavia, le tecnologie ad alta risoluzione e un numero emergente di modelli di cellule staminali embrionali ^1,2 rivelano un'eterogeneità senza precedenti tra gli strati germinali precoci ^3,4

Protocol

Questo protocollo e tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati formalmente approvati e in conformità con le linee guida istituzionali stabilite dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Temple University, che segue le linee guida internazionali dell'Associazione per la Valutazione e l'Accreditamento della Cura degli Animali da Laboratorio. Tutti i topi descritti erano sul ceppo di fondo C57/BL6N. In questi studi non sono stati osservati problemi di salute animale.

Discussion

In questo articolo viene presentata una robusta pipeline per ottenere sospensioni di singole cellule e nuclei di alta qualità da embrioni di topo gastrulanti, specificamente progettata per facilitare gli studi sui meccanismi di specificazione del destino cellulare nelle prime fasi di sviluppo. Questo metodo affronta una lacuna cruciale nel campo della gastrulazione ottimizzando l'analisi degli embrioni che richiedono genotipi, come il sesso o i geni somatici. Utilizzando modelli murini di mutazione genetica e impiegando.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000