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用于分析各种细胞类型中核体动态变化的多功能管道
In This Article
Summary
该方法描述了一种免疫荧光方案和定量管道，用于评估人 T 淋巴细胞中具有不同核组织模式的蛋白质分布。该协议提供了分步指导，从样品制备开始，一直到斐济的半自动分析执行，最后通过 Google Colab 笔记本进行数据处理。
Abstract
各种核过程，例如转录控制，发生在称为病灶的离散结构中，可通过免疫荧光技术进行识别。通过显微镜研究这些病灶在不同细胞条件下的动力学，可以深入了解控制细胞身份和功能的分子机制。然而，对不同细胞类型进行免疫荧光检测并评估这些病灶的组装、扩散和分布的改变存在许多挑战。这些挑战包括样品制备、分析成像数据的参数确定以及大量数据管理方面的复杂性。此外，现有的成像工作流程通常是为熟练用户量身定制的，因此限制了更广泛的受众的可访问性。
在这项研究中，我们引入了一种优化的免疫荧光方案，该方案专为研究不同人类原代 T 细胞类型中的核蛋白而量身定制，该方案可以针对任何感兴趣的蛋白质和细胞类型进行定制。此外，我们提出了一种无偏量化蛋白质染色的方法，无论它们是否形成不同的病灶或表现出弥漫的核分布。
我们提出的方法提供了一个全面的指南，从细胞染色到分析，利用在 Jython 中开发并在斐济执行的半自动化管道。此外，我们还提供了一个用户友好的 Python 脚本来简化数据管理，可在 Google Colab 笔记本上公开访问。我们的方法已证明对在不同环境中具有不同核组织模式的蛋白质进行信息丰富的免疫荧光分析的有效性。
Introduction
真核生物基因组的组织由多层表观遗传修饰1 控制，协调可能发生在称为核体或凝聚物2 的特殊隔室中的几种核功能。在这些结构中，发生转录起始3、RNA 加工 4,5,6、DNA 修复 7,8、核糖体生物发生9、10、11 和异染色质调节12,13 等过程。在相分离原理的指导下，核体的调节在空间和时间维度上进行调整，以适应细胞需求14,15。因此，这些物体充当了瞬态工厂的功能，功能组件在这里组装和拆卸，大小和空间分布发生变化。因此，通过显微镜了解核蛋白的特性，包括它们形成体的倾向及....
Protocol
将人类样本用于研究目的已获得 Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico （IRCCS） Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico（米兰）伦理委员会的批准，并获得了所有受试者的知情同意（授权号：708_2020）。该方案分为三个主要部分：免疫荧光执行、图像采集和图像分析。平均而言，需要 4 个工作日才能完成（图 1）。
1. 免疫荧光制备
Representative Results
该方法中概述的方案有助于可视化和量化人原代 T 细胞内核蛋白染色的改变，并且可以针对不同的细胞类型和蛋白质靶标进行定制。作为案例研究，我们进行并分析了幼稚细胞和 TH1 CD4 + 细胞中 BRD4 和 SUZ12 的染色。
BRD4 在静止幼稚和分化的 TH1 CD4 + 细胞中均显示出良好的点状染色模式，因此能够使用设计的参数对两种细胞类型进行.......
Discussion
在这项研究中，我们提出了一种对人 T 淋巴细胞中的核蛋白进行免疫荧光实验的方法。如前所述，该方法通过对固定和透化步骤的微小修改，为各种细胞类型提供了灵活性30,31。
我们的成像工作流程建立在文献中概述的既定技术之上，特别是 FindFoci 和 3D Suite 22,23。与以前的出版物不同，?.......
Disclosures
R.V. 与初创公司 T-One Therapeutics Srl 有科学合作;B.B. 和 F.M. 是初创公司 T-One Therapeutics Srl 的联合创始人;E.P. 目前受雇于 T-One Therapeutics Srl;所有其他作者都声明他们没有利益冲突。
Acknowledgements
我们感谢 INGM 成像设施的科学和技术援助，特别是 C. Cordiglieri 和 A. Fasciani，以及 INGM FACS 分拣设施，特别是 M.C Crosti（意大利米兰 'Romeo ed Enrica Invernizzi' （INGM） 国家遗传学研究所）。感谢 M. Giannaccari 提供的信息技术支持。这项工作由以下赠款资助：Fondazione Cariplo（Bando Giovani，赠款 nr 2018-0321）和 Fondazione AIRC（赠款 nr MFAG 29165）给 FM Ricerca Finalizzata（赠款 nr GR-2018-12365280）、Fondazione AIRC（赠款 nr 2022 27066）、Fondazione Cariplo（赠款 nr 2019-3416）、Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica （FRRB CP2_12/2018）、Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza （PNRR）（赠款 nr G43C22002620007）和 Progetti di Rilevante Interesse Nazionale （PRIN）（赠款 nr 2022PKF9S）给 B。B.
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Safe-Lock Tubes | Eppendord | #0030121503 | Protocol section 1 |
| 10 mL Serological pipettes | VWR | #612-3700 | Protocol section 1 |
| 20 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2149P-HR | Protocol section 1 |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | #352070 | Protocol section 1 |
| 200 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2069-HR | Protocol section 1 |
| antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia | Invitrogen | #P36984 | Step 1.3.12 |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | #A7030 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
| CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | #130-096-533 | Step 1.1.2. |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | Cat#D1306 | Step 1.3.10. |
| Dry ice | Step 1.3.1. | ||
| Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead | Life Technologies | #1131D | magnetic beads step 1.1.4. |
| EtOH | Carlo Erba | #4146320 | Step 1.2.1.1. |
| FACSAria SORP | BD Bioscences | Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | #10270106 | Step 1.1.4 |
| FICOLL PAQUE PLUS | Euroclone | GEH17144003F32 | Step 1.1.1. |
| FIJI Version 2.14.0 | - | - | Protocol section 3 |
| Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H) | Electron Microscopy Sciences | #72298-13 | Step 1.2.1. |
| Glycerol | Sigma | #G5516 | Step 1.2.7-1.3.1. |
| Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Step 1.3.8. |
| HCl | Sigma | #320331 | Step 1.3.4. |
| human neutralizing anti-IL-4 | Miltenyi Biotec | Cat#130-095-753 | Step 1.1.4. |
| human recombinant IL-12 | Miltenyi Biotec | Cat#130-096-704 | Step 1.1.4. |
| human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | Cat#130-097-744 | Step 1.1.4. |
| Leica TCS SP5 Confocal microscope | Leica Microsystems | - | Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | #11140035 | Step 1.1.4. |
| Microscope Slides | VWR | #631-1552 | Step 1.3.12. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone) | BD Bioscience | #557871 | Step 1.1.3. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone) | BD Bioscience | #552888 | Step 1.1.3. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone) | Miltenyi Biotec | #130-113-546 | Step 1.1.3. |
| Multiwell 24 well | Falcon | #353047 | Protocol section 1 |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
| PBS | Life Technologies | #14190094 | Protocol section 1 |
| Penicillin/Streptomycin solution | Life Technologies | #15070063 | Step 1.1.4. |
| PFA | Sigma | #P6148 | Step 1.2.4. |
| poly-L-lysine | Sigma | #P8920 | 1.2.1. |
| Primary antibody - BRD4 | Abcam | #ab128874 | Step 1.3.6. |
| Primary antibody - SUZ12 | Cel Signalling | mAb #3737 | Step 1.3.6. |
| RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I | Life Technologies | #61870010 | Step 1.1.4. |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | #11360039 | Step 1.1.4. |
| Triton X-100 | Sigma | #T8787 | Step 1.2., 1.3. |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | Step 1.3. |
| Tweezers | - | - | Protocol section 1 |
References
- Aboelnour, E., Bonev, B. Decoding the organization, dynamics, and function of the 4D genome. Dev Cell. 56 (11), 1562-1573 (2021).
- Erdel, F., Rippe, K. Formation of chromatin subcompartments by phase separation.
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