A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
שיטה זו מתארת פרוטוקול אימונופלואורסנציה וצינור כימות להערכת התפלגות חלבונים עם דפוסי ארגון גרעיני מגוונים בלימפוציטים מסוג T אנושיים. פרוטוקול זה מספק הדרכה שלב אחר שלב, החל מהכנת הדגימה והמשך בביצוע ניתוח חצי אוטומטי בפיג'י, וכלה בטיפול בנתונים על ידי מחברת Google Colab.
תהליכים גרעיניים שונים, כגון בקרת שעתוק, מתרחשים בתוך מבנים בדידים המכונים מוקדים הניתנים להבחנה באמצעות טכניקת האימונופלואורסנציה. חקירת הדינמיקה של מוקדים אלה בתנאים תאיים מגוונים באמצעות מיקרוסקופיה מניבה תובנות חשובות על המנגנונים המולקולריים השולטים בזהות התאית ובתפקודיה. עם זאת, ביצוע בדיקות אימונופלואורסנציה על פני סוגי תאים שונים והערכת שינויים בהרכבה, דיפוזיה והפצה של מוקדים אלה מציבים אתגרים רבים. אתגרים אלה כוללים מורכבויות בהכנת הדגימות, קביעת פרמטרים לניתוח נתוני הדמיה וניהול נפחי נתונים משמעותיים. יתר על כן, תהליכי עבודה קיימים של הדמיה מותאמים לעתים קרובות למשתמשים מיומנים, ובכך מגבילים את הנגישות לקהל רחב יותר.
במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול אימונופלואורסנציה אופטימלי המותאם לחקר חלבונים גרעיניים בסוגים שונים של תאי T ראשוניים אנושיים שניתן להתאים אישית לכל חלבון מעניין וסוג תא. יתר על כן, אנו מציגים שיטה לכימות בלתי משוחד של צביעת חלבונים, בין אם הם יוצרים מוקדים נפרדים או מציגים פיזור גרעיני מפוזר.
השיטה המוצעת שלנו מציעה מדריך מקיף, החל מצביעה סלולרית ועד ניתוח, תוך מינוף צינור חצי אוטומטי שפותח ב- Jython וניתן להפעלה בפיג'י. יתר על כן, אנו מספקים סקריפט Python ידידותי למשתמש כדי לייעל את ניהול הנתונים, נגיש לציבור במחשב נייד של Google Colab. הגישה שלנו הוכיחה יעילות בהפקת ניתוחים אימונופלואורסצנטיים אינפורמטיביים ביותר עבור חלבונים עם דפוסים מגוונים של ארגון גרעיני בהקשרים שונים.
ארגון הגנום האיקריוטי נשלט על ידי שכבות מרובות של שינויים אפיגנטיים1, המתאמים מספר פונקציות גרעיניות שיכולות להתרחש בתוך תאים מיוחדים הנקראים גופים גרעיניים או מעובים2. בתוך מבנים אלה מתרחשים תהליכים כגון התחלת שעתוק3, עיבוד RNA 4,5,6, תיקון DNA 7,8, ביוגנזה של ריבוזום 9,10,11 וויסות הטרוכרומטין12,13.
השימוש בדגימות אנושיות למטרות מחקר אושר על ידי ועדות האתיקה של Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (מילאנו), והתקבלה הסכמה מדעת מכל הנבדקים (מספרי הרשאה: 708_2020). הפרוטוקול מאורגן בשלושה חלקים עיקריים: ביצוע immunofluorescence, רכישת תמונה וניתוח תמונה. בממוצע, נדרשים 4 ימי עב?.......
הפרוטוקול המתואר בשיטה זו מאפשר הדמיה וכימות של שינויים בצביעת חלבונים גרעיניים בתוך תאי T ראשוניים אנושיים, וניתן להתאים אותו למגוון סוגי תאים ומטרות חלבון. כמקרי בוחן, ערכנו וניתחנו את הצביעה של BRD4 ו-SUZ12 בתאים נאיביים ובתאי TH1 CD4+ .
BRD4 מציג תבנית צביעה מנוקדת.......
במחקר זה אנו מציגים שיטה לביצוע ניסויים אימונופלואורסנטיים על חלבונים גרעיניים בלימפוציטים אנושיים מסוג T. שיטה זו מציעה גמישות לשימוש עם סוגי תאים שונים באמצעות שינויים קלים בשלבי הקיבוע והחלחול, כפי שתואר קודם לכן30,31.
תהליך העבודה שלנו לה?.......
אנו מכירים בסיוע המדעי והטכני של מתקן ההדמיה של INGM, בפרט, C. Cordiglieri ו- A. Fasciani, ומתקן המיון של INGM FACS בפרט M.C Crosti (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare 'Romeo ed Enrica Invernizzi' (INGM), מילאנו, איטליה). אנו מודים ל- M. Giannaccari על תמיכתו הטכנית האינפורמטית. עבודה זו מומנה על ידי המענקים הבאים: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321) ו- Fondazione AIRC (grant nr MFAG 29165) ל- F.M. Ricerca Finalizzata, (grant nr GR-2018-12365280), Fondazione AIRC (grant nr 2022 27066), Fondazione Cariplo (grant nr 2019-3416), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB CP2_12/2018,) Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR) (gran....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL Safe-Lock Tubes | Eppendord | #0030121503 | Protocol section 1 |
10 mL Serological pipettes | VWR | #612-3700 | Protocol section 1 |
20 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2149P-HR | Protocol section 1 |
50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | #352070 | Protocol section 1 |
200 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2069-HR | Protocol section 1 |
antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia | Invitrogen | #P36984 | Step 1.3.12 |
BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | #A7030 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | #130-096-533 | Step 1.1.2. |
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | Cat#D1306 | Step 1.3.10. |
Dry ice | Step 1.3.1. | ||
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead | Life Technologies | #1131D | magnetic beads step 1.1.4. |
EtOH | Carlo Erba | #4146320 | Step 1.2.1.1. |
FACSAria SORP | BD Bioscences | Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | #10270106 | Step 1.1.4 |
FICOLL PAQUE PLUS | Euroclone | GEH17144003F32 | Step 1.1.1. |
FIJI Version 2.14.0 | - | - | Protocol section 3 |
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H) | Electron Microscopy Sciences | #72298-13 | Step 1.2.1. |
Glycerol | Sigma | #G5516 | Step 1.2.7-1.3.1. |
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Step 1.3.8. |
HCl | Sigma | #320331 | Step 1.3.4. |
human neutralizing anti-IL-4 | Miltenyi Biotec | Cat#130-095-753 | Step 1.1.4. |
human recombinant IL-12 | Miltenyi Biotec | Cat#130-096-704 | Step 1.1.4. |
human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | Cat#130-097-744 | Step 1.1.4. |
Leica TCS SP5 Confocal microscope | Leica Microsystems | - | Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel. |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | #11140035 | Step 1.1.4. |
Microscope Slides | VWR | #631-1552 | Step 1.3.12. |
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone) | BD Bioscience | #557871 | Step 1.1.3. |
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone) | BD Bioscience | #552888 | Step 1.1.3. |
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone) | Miltenyi Biotec | #130-113-546 | Step 1.1.3. |
Multiwell 24 well | Falcon | #353047 | Protocol section 1 |
Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
PBS | Life Technologies | #14190094 | Protocol section 1 |
Penicillin/Streptomycin solution | Life Technologies | #15070063 | Step 1.1.4. |
PFA | Sigma | #P6148 | Step 1.2.4. |
poly-L-lysine | Sigma | #P8920 | 1.2.1. |
Primary antibody - BRD4 | Abcam | #ab128874 | Step 1.3.6. |
Primary antibody - SUZ12 | Cel Signalling | mAb #3737 | Step 1.3.6. |
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I | Life Technologies | #61870010 | Step 1.1.4. |
Sodium Pyruvate | Life Technologies | #11360039 | Step 1.1.4. |
Triton X-100 | Sigma | #T8787 | Step 1.2., 1.3. |
TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | Step 1.3. |
Tweezers | - | - | Protocol section 1 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved