צינור רב-תכליתי לניתוח שינויים דינמיים בגופים גרעיניים במגוון סוגי תאים

Summary

שיטה זו מתארת פרוטוקול אימונופלואורסנציה וצינור כימות להערכת התפלגות חלבונים עם דפוסי ארגון גרעיני מגוונים בלימפוציטים מסוג T אנושיים. פרוטוקול זה מספק הדרכה שלב אחר שלב, החל מהכנת הדגימה והמשך בביצוע ניתוח חצי אוטומטי בפיג'י, וכלה בטיפול בנתונים על ידי מחברת Google Colab.

Abstract

תהליכים גרעיניים שונים, כגון בקרת שעתוק, מתרחשים בתוך מבנים בדידים המכונים מוקדים הניתנים להבחנה באמצעות טכניקת האימונופלואורסנציה. חקירת הדינמיקה של מוקדים אלה בתנאים תאיים מגוונים באמצעות מיקרוסקופיה מניבה תובנות חשובות על המנגנונים המולקולריים השולטים בזהות התאית ובתפקודיה. עם זאת, ביצוע בדיקות אימונופלואורסנציה על פני סוגי תאים שונים והערכת שינויים בהרכבה, דיפוזיה והפצה של מוקדים אלה מציבים אתגרים רבים. אתגרים אלה כוללים מורכבויות בהכנת הדגימות, קביעת פרמטרים לניתוח נתוני הדמיה וניהול נפחי נתונים משמעותיים. יתר על כן, תהליכי עבודה קיימים של הדמיה מותאמים לעתים קרובות למשתמשים מיומנים, ובכך מגבילים את הנגישות לקהל רחב יותר.

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול אימונופלואורסנציה אופטימלי המותאם לחקר חלבונים גרעיניים בסוגים שונים של תאי T ראשוניים אנושיים שניתן להתאים אישית לכל חלבון מעניין וסוג תא. יתר על כן, אנו מציגים שיטה לכימות בלתי משוחד של צביעת חלבונים, בין אם הם יוצרים מוקדים נפרדים או מציגים פיזור גרעיני מפוזר.

השיטה המוצעת שלנו מציעה מדריך מקיף, החל מצביעה סלולרית ועד ניתוח, תוך מינוף צינור חצי אוטומטי שפותח ב- Jython וניתן להפעלה בפיג'י. יתר על כן, אנו מספקים סקריפט Python ידידותי למשתמש כדי לייעל את ניהול הנתונים, נגיש לציבור במחשב נייד של Google Colab. הגישה שלנו הוכיחה יעילות בהפקת ניתוחים אימונופלואורסצנטיים אינפורמטיביים ביותר עבור חלבונים עם דפוסים מגוונים של ארגון גרעיני בהקשרים שונים.

Introduction

ארגון הגנום האיקריוטי נשלט על ידי שכבות מרובות של שינויים אפיגנטיים¹, המתאמים מספר פונקציות גרעיניות שיכולות להתרחש בתוך תאים מיוחדים הנקראים גופים גרעיניים או מעובים². בתוך מבנים אלה מתרחשים תהליכים כגון התחלת שעתוק³, עיבוד RNA ^4,5,6, תיקון DNA ^7,8, ביוגנזה של ריבוזום ^9,10,11 וויסות הטרוכרומטין^12,13.

Protocol

השימוש בדגימות אנושיות למטרות מחקר אושר על ידי ועדות האתיקה של Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (מילאנו), והתקבלה הסכמה מדעת מכל הנבדקים (מספרי הרשאה: 708_2020). הפרוטוקול מאורגן בשלושה חלקים עיקריים: ביצוע immunofluorescence, רכישת תמונה וניתוח תמונה. בממוצע, נדרשים 4 ימי עב?.......

Discussion

במחקר זה אנו מציגים שיטה לביצוע ניסויים אימונופלואורסנטיים על חלבונים גרעיניים בלימפוציטים אנושיים מסוג T. שיטה זו מציעה גמישות לשימוש עם סוגי תאים שונים באמצעות שינויים קלים בשלבי הקיבוע והחלחול, כפי שתואר קודם לכן^30,31.

תהליך העבודה שלנו לה?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Safe-Lock Tubes	Eppendord	#0030121503	Protocol section 1
10 mL Serological pipettes	VWR	#612-3700	Protocol section 1
20 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2149P-HR	Protocol section 1
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	#352070	Protocol section 1
200 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2069-HR	Protocol section 1
antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia	Invitrogen	#P36984	Step 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	#A7030	Step 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T Cell Isolation Kit	Miltenyi Biotec	#130-096-533	Step 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	Cat#D1306	Step 1.3.10.
Dry ice			Step 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead	Life Technologies	#1131D	magnetic beads step 1.1.4.
EtOH	Carlo Erba	#4146320	Step 1.2.1.1.
FACSAria SORP	BD Bioscences		Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	#10270106	Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS	Euroclone	GEH17144003F32	Step 1.1.1.
FIJI Version 2.14.0	-	-	Protocol section 3
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)	Electron Microscopy Sciences	#72298-13	Step 1.2.1.
Glycerol	Sigma	#G5516	Step 1.2.7-1.3.1.
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody	Invitrogen	A11036	Step 1.3.8.
HCl	Sigma	#320331	Step 1.3.4.
human neutralizing anti-IL-4	Miltenyi Biotec	Cat#130-095-753	Step 1.1.4.
human recombinant IL-12	Miltenyi Biotec	Cat#130-096-704	Step 1.1.4.
human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	Cat#130-097-744	Step 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscope	Leica Microsystems	-	Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Life Technologies	#11140035	Step 1.1.4.
Microscope Slides	VWR	#631-1552	Step 1.3.12.
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)	BD Bioscience	#557871	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)	BD Bioscience	#552888	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)	Miltenyi Biotec	#130-113-546	Step 1.1.3.
Multiwell 24 well	Falcon	#353047	Protocol section 1
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000	Step 1.3.6., 1.3.8.
PBS	Life Technologies	#14190094	Protocol section 1
Penicillin/Streptomycin solution	Life Technologies	#15070063	Step 1.1.4.
PFA	Sigma	#P6148	Step 1.2.4.
poly-L-lysine	Sigma	#P8920	1.2.1.
Primary antibody - BRD4	Abcam	#ab128874	Step 1.3.6.
Primary antibody - SUZ12	Cel Signalling	mAb #3737	Step 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I	Life Technologies	#61870010	Step 1.1.4.
Sodium Pyruvate	Life Technologies	#11360039	Step 1.1.4.
Triton X-100	Sigma	#T8787	Step 1.2., 1.3.
TWEEN 20	Sigma	#P9416	Step 1.3.
Tweezers	-	-	Protocol section 1