Um pipeline versátil para analisar mudanças dinâmicas em corpos nucleares em uma variedade de tipos de células

Summary

Este método descreve um protocolo de imunofluorescência e pipeline de quantificação para avaliar a distribuição de proteínas com padrões variados de organização nuclear em linfócitos T humanos. Este protocolo fornece orientação passo a passo, começando pela preparação da amostra e continuando com a execução da análise semiautomatizada em Fiji, concluindo com o tratamento de dados por um notebook Google Colab.

Abstract

Vários processos nucleares, como o controle transcricional, ocorrem dentro de estruturas discretas conhecidas como focos que são discerníveis através da técnica de imunofluorescência. Investigar a dinâmica desses focos sob diversas condições celulares por meio de microscopia produz informações valiosas sobre os mecanismos moleculares que governam a identidade e as funções celulares. No entanto, a realização de ensaios de imunofluorescência em diferentes tipos de células e a avaliação de alterações na montagem, difusão e distribuição desses focos apresentam inúmeros desafios. Esses desafios abrangem complexidades na preparação de amostras, determinação de parâmetros para análise de dados de imagem e gerenciamento de volumes substanciais de dados. Além disso, os fluxos de trabalho de imagem existentes geralmente são adaptados para usuários proficientes, limitando assim a acessibilidade a um público mais amplo.

Neste estudo, apresentamos um protocolo de imunofluorescência otimizado adaptado para investigar proteínas nucleares em diferentes tipos de células T primárias humanas que podem ser personalizadas para qualquer proteína de interesse e tipo de célula. Além disso, apresentamos um método para quantificar de forma imparcial a coloração de proteínas, quer elas formem focos distintos ou exibam uma distribuição nuclear difusa.

Nosso método proposto oferece um guia abrangente, desde a coloração celular até a análise, aproveitando um pipeline semiautomatizado desenvolvido em Jython e executável em Fiji. Além disso, fornecemos um script Python fácil de usar para simplificar o gerenciamento de dados, acessível publicamente em um notebook do Google Colab. Nossa abordagem demonstrou eficácia em produzir análises de imunofluorescência altamente informativas para proteínas com diversos padrões de organização nuclear em diferentes contextos.

Introduction

A organização do genoma eucariótico é governada por múltiplas camadas de modificações epigenéticas¹, coordenando várias funções nucleares que podem ocorrer dentro de compartimentos especializados chamados corpos nucleares ou condensados². Dentro dessas estruturas, ocorrem processos como iniciação da transcrição³, processamento de RNA ^4,5,6, reparo de DNA ^7,8, biogênese do ribossomo ^9,10,11....

Protocol

O uso de amostras humanas para fins de pesquisa foi aprovado pelos Comitês de Ética da Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Milão), e o consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos (números de autorização: 708_2020). O protocolo é organizado em três seções principais: execução de imunofluorescência, aquisição de imagem e análise de imagem. Em média, são necessários 4 dias úteis para ser concluído (

Discussion

Neste estudo, apresentamos um método para a realização de experimentos de imunofluorescência em proteínas nucleares em linfócitos T humanos. Esse método oferece flexibilidade para uso com vários tipos de células por meio de pequenas modificações nas etapas de fixação e permeabilização, conforme descrito anteriormente^30,31.

Nosso fluxo de trabalho de imagem baseia-se em técnicas estabelecidas descritas na literatura, esp.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Safe-Lock Tubes	Eppendord	#0030121503	Protocol section 1
10 mL Serological pipettes	VWR	#612-3700	Protocol section 1
20 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2149P-HR	Protocol section 1
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	#352070	Protocol section 1
200 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2069-HR	Protocol section 1
antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia	Invitrogen	#P36984	Step 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	#A7030	Step 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T Cell Isolation Kit	Miltenyi Biotec	#130-096-533	Step 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	Cat#D1306	Step 1.3.10.
Dry ice			Step 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead	Life Technologies	#1131D	magnetic beads step 1.1.4.
EtOH	Carlo Erba	#4146320	Step 1.2.1.1.
FACSAria SORP	BD Bioscences		Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	#10270106	Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS	Euroclone	GEH17144003F32	Step 1.1.1.
FIJI Version 2.14.0	-	-	Protocol section 3
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)	Electron Microscopy Sciences	#72298-13	Step 1.2.1.
Glycerol	Sigma	#G5516	Step 1.2.7-1.3.1.
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody	Invitrogen	A11036	Step 1.3.8.
HCl	Sigma	#320331	Step 1.3.4.
human neutralizing anti-IL-4	Miltenyi Biotec	Cat#130-095-753	Step 1.1.4.
human recombinant IL-12	Miltenyi Biotec	Cat#130-096-704	Step 1.1.4.
human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	Cat#130-097-744	Step 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscope	Leica Microsystems	-	Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Life Technologies	#11140035	Step 1.1.4.
Microscope Slides	VWR	#631-1552	Step 1.3.12.
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)	BD Bioscience	#557871	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)	BD Bioscience	#552888	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)	Miltenyi Biotec	#130-113-546	Step 1.1.3.
Multiwell 24 well	Falcon	#353047	Protocol section 1
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000	Step 1.3.6., 1.3.8.
PBS	Life Technologies	#14190094	Protocol section 1
Penicillin/Streptomycin solution	Life Technologies	#15070063	Step 1.1.4.
PFA	Sigma	#P6148	Step 1.2.4.
poly-L-lysine	Sigma	#P8920	1.2.1.
Primary antibody - BRD4	Abcam	#ab128874	Step 1.3.6.
Primary antibody - SUZ12	Cel Signalling	mAb #3737	Step 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I	Life Technologies	#61870010	Step 1.1.4.
Sodium Pyruvate	Life Technologies	#11360039	Step 1.1.4.
Triton X-100	Sigma	#T8787	Step 1.2., 1.3.
TWEEN 20	Sigma	#P9416	Step 1.3.
Tweezers	-	-	Protocol section 1