マウスにおける歯列矯正の歯の動きの研究

要約

ここでは、歯列矯正用歯の動き(OTM)を研究するためのプロトコルを提示し、骨の適応、根の吸収、および機械的刺激に対する骨細胞の応答のメカニズムを調査するための適切なモデルとして機能します。この包括的なガイドでは、OTMモデル、マイクロコンピューター断層撮影の取得、およびその後の分析について詳しく説明します。

要約

歯列矯正用歯の動き(OTM)は、破骨細胞と骨芽細胞によってそれぞれ調整された、歯槽骨が圧迫部位で吸収され、張力部位で沈着するダイナミックなプロセスを表しています。このメカニズムは、根の吸収や機械的な力の刺激に対する細胞の応答など、骨の適応のさまざまな側面を研究するための貴重なモデルとして機能します。ここで概説するプロトコルは、OTMを調査するための簡単なアプローチを提供し、ニッケルチタン(NiTi)コイルスプリングを使用するマウスモデルで0.35Nを最適な力として確立します。マイクロコンピュータ断層撮影法を用いて、セメント-エナメル接合部における直線距離の不一致を評価することにより、OTMを定量化した。評価には、歯列矯正による炎症性根吸収の分析も含まれており、根のミネラル密度や総体積あたりの根の体積の割合などのパラメーターが評価されました。この包括的なプロトコールは、骨のリモデリングプロセスの理解を深め、効果的な矯正治療戦略を開発する能力を高めることに貢献しています。

概要

骨リモデリングは、破骨細胞、骨芽細胞、骨内層細胞、および骨細胞によって調整される進行中のプロセスであり、成人の骨格の完全性を維持するために不可欠です^1,2。主に破骨細胞と骨芽細胞の分化と活性によって駆動されるこのダイナミックなプロセスは、機械的ストレスと負荷^3,4,5によって引き起こされる骨の再吸収と沈着を伴います。

動物実験は、歯列矯正の歯の動き(OTM)^6,7を支える複雑な生物学的および細胞的メカニズムを解明する上で極めて重要な役割を果たします。このプロセスには、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、線維芽細胞、および顎骨と歯根膜内に位置するマクロファージやT細胞などの免疫細胞など、さまざまな種類の細胞が関与します^7,8。これらの細胞は、機械的刺激や局所的な環境の変化に動的に応答し、周囲の骨の組成や構造に影響を与える^7,8。さらに、病原体が存在しないにもかかわらず、細胞レベルで炎症反応を引き起こします。この炎症反応は、骨組織の代謝回転を増加させる役割を果たします⁹。

マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルなど、さまざまな動物モデルがOTM ^7,8,10の実験的研究に利用されています。これらの中で、げっ歯類、特にマウスは、歯の動きと骨^{のリモデリング}6の初期段階を調査するために好まれています。これまでの研究では、主に遺伝子組み換え株が広く利用可能であるため、ラットモデルよりもマウスモデルを使用する利点が強調されており、OTM ^7,11における遺伝的影響の詳細な調査が可能になりました。現在、マウスの歯の動きを誘導するために、大きく分けて2つのモデルが用いられています。第1の方法は、第1上顎大臼歯と上顎切歯^4,12の間にニッケルチタン(NiTi)コイルスプリングを挿入することを伴う。第2のアプローチは、第1および第2の上顎大臼歯¹³との間の歯間腔内に弾性バンドを配置することを含む。分析される主要なアウトカムは、典型的には、歯の動きの大きさおよび骨のマイクロアーキテクチャを含み、好ましくはマイクロコンピュータ断層撮影法(マイクロCT)を用いて評価される¹⁴。理想的には、OT^M4を生成するために適切な力が使用されていることを確認するために、歯根の完全性を評価することが重要です。

マイクロCTは、石灰化組織のマイクロアーキテクチャを評価するためのゴールドスタンダードとして広く認識されています¹⁴が、データのスキャン、分析、および報告のための標準化された方法論とプロトコルの欠如は、採用された正確な手順を識別し、結果を解釈し、異なるOTMモデル間の比較を容易にする上でしばしば課題を提示します^14,15。

ここでは、OTM、骨の微細構造、歯根のマイクロCT取得と解析など、OTMマウスモデルのステップバイステップガイドを紹介します。この方法では、制御された機械的な力を第一大臼歯に加え、顎骨内での動きを誘発します。この方法の選択は、実現可能性、関連性、精度など、いくつかの要因に起因します。このようなアプローチにより、詳細な定量分析が可能になり、歯列矯正の歯の動きの根底にある生物学的プロセスに関する貴重な洞察が得られ、将来の改善された矯正治療戦略の開発が容易になります。

プロトコル

すべての手続きは、ミナスジェライス連邦大学倫理委員会(No.166/2022)によって確立された倫理基準に厳密に準拠していました。各実験の前に、サンプルサイズの計算は必須です。体重約20〜30gの8〜10週齢の雄C57BL6 / J野生型マウスを使用してください。マウスは、25°Cに維持された室内のケージに収容し、12時間の光/12時間の暗サイクルに従う必要があります。コイルを取り付けた後、動物には柔らかい食事を与える必要があります。毎日のモニタリングには、体重と全体的な健康状態の評価を含める必要があります。

1. 機械的に誘導された歯槽骨リモデリング

1. 遠位カットペンチを使用して、0.25 x 0.76インチのNiTiオープンコイルスプリングを、歯列矯正用ワインガートプライヤーを使用して、スプリングに対して垂直に配置された6つのループと2つのループ形状の端の次の寸法にカットします。
2. 直径0.20mmの丸型クロムニッケル(CrNi)ワイヤーを、Mathieuピンセットと丸型器具をサイズ基準として使用して、端をループ状にして目的の構成に成形します。
3. コイルのループ状の端と0.20mmの丸いCrNiワイヤーを組み立てます。
4. キシラジン(10 mg / Kg)とケタミン(100 mg / Kg)を含む0.2 mLの溶液の腹腔内注射で動物に麻酔をかけます。.手順を開始する前に、ペダル反射を使用して麻酔の深さを評価してください。ピンセットを使用して動物のつま先のいずれかを慎重につまみます。反射がないことは、全身麻酔の適切な平面を示しています。角膜の損傷や術後の痛みを避けるために、動物が麻酔された後に眼の潤滑剤を塗布してください。
5. 動物を背側褥瘡に座らせ、手術台の上に置き、手足を固定して動きを制限し、口腔内アクセスを可能にします。
6. 直径0.50mmのワイヤーで作られ、0.08mmのワイヤーで固定された開口器を利用して、頭の動きを防ぎながら完全な視覚化を容易にします。右側を実験側(OTM側)、左側を矯正コイルなしのコントロール(コントロール側)として使用します。
   注:口腔内構造の視覚化を強化するには、実体顕微鏡と光学光システムを使用して達成する必要があります。
7. 右の第一大臼歯と切歯の表面をそれぞれアセトンとセルフエッチングプライマーを使用して清掃し、エッチングします。このシステムはセルフエッチングであるため、事前の酸コンディショニングは必要ありません。
   1. プライマーを1つのステップで塗布し、酸と接着剤として同時に機能します。マイクロブラシを使用して、少量のセルフエッチングプライマーを収集し、上部第一大臼歯と切歯の咬合面に塗布します。このステップでは、セルフエッチングプライマーが第一大臼歯と第二大臼歯の間の近位表面に到達しないように注意する必要があります。これにより、歯の要素がくっついて歯の動きが妨げられる可能性があります。大臼歯と切歯の咬合面でプライマーを30秒間光硬化させます。
8. 6ループNiTiオープンコイルスプリングの遠位端を右上顎大臼歯の咬合面に光硬化樹脂で接着し、30秒間光硬化させます。ワイヤーの端にレジンのインクリメントを追加して、マウスへの害を防ぎ、30秒間光硬化させます。
9. 手術台に取り付けられたレールとクランク機構からなる特別に設計された装置を使用して、コイルを作動させます。これにより、前後方向の動きを前後にスライドさせることができます。
10. 0.20mmの丸線のフリーループ形状の端をテンションゲージのフックに接続します。
11. クランクを作動させたら、ダイナモメーターが0.35Nの力を記録するまで、手術台をレールに沿って動かします。
12. 0.20mmの丸線を両方の上切歯に接着して、コイルを固定します。実験期間中は、それ以上の再活性化は行われません。ワイヤーを切断して、動物をダイナモメーターから切り離します。 さらに樹脂を少し加えると、デバイスの金属エッジが露出したり、動物を傷つけたりしないようにします。30秒間の光硬化。動物をテーブルから分解します。
13. 近心方向に0.35Nの力を課す装置を備えた右上の第一大臼歯は、実験側で構成されています。上顎骨の左側(歯列矯正器具なし)をコントロール^4,16として使用します。
14. このデバイスを12日間維持し、アクティベーションは必要ありません。鎮痛剤は使用しないでください。歯列矯正の動きは炎症過程を通じて起こり、鎮痛薬はアラキドン酸カスケードに悪影響を及ぼし、骨のリモデリング速度に影響を与え、結果を無効にする可能性があります。
15. 手術終了後、生理食塩水の皮下注射で動物を治療し、デバイスによる適応期間中の脱水症状を回避します。動物を完全に回復するまで、動物を加熱して個々のケージに入れ、この期間が経過すると動物を集合ケージに入れます。
16. キシラジン (10 mg/Kg) とケタミン (100 mg/Kg) を含む 0.2 mL 溶液の腹腔内注射による鎮静による 12^日目にマウスを安楽死させ、その後鋭利なハサミで斬首します。

2. マイクロCT測定

1. 鋭利なハサミで上顎骨を採取し、すべての軟部組織を切断し、矢状面の頬骨を、冠状面の前鼻縫合糸と蓮状後頭部シンコンドロシスを切除します。上顎骨を10%中性緩衝ホルマリン(pH = 7.4)に48時間の固定期間浸します。この期間の後、ホルムアルデヒド溶液を70%アルコールに変更します。
2. 高解像度スキャンのために、9〜18μmの等方性ボクセルサイズ、50kVのX線設定、0.5mmのアルミニウムフィルター、0.5°の回転角度のパラメータを使用して、上顎骨のマイクロCTスキャンを実行します。マイクロCTスキャンでは、複数のジョーを装着することができます。
3. 使用されたマイクロコンピューター断層撮影(microCT)の製造元によって示されたマイクロトモグラフィー再構成プログラムを使用して、取得した画像を再構築します¹⁷。
4. 使用したマイクロトモグラフィーの製造元が示す3D検査プログラムを使用して、再構築された画像を配置します。
5. 右上顎骨(OTM側)の第1大臼歯と第2大臼歯のセメント-エナメル接合部(CEJ)と左半上顎骨(対照側)の直線距離の差を測定することにより、OTMを定量化します。この測定には、ラインツールを備えた適切なmicroCTアナライザーソフトウェアを利用します ^17,18,19,20.
6. 歯列矯正誘発性炎症性根吸収(OIIRR)の存在についてサンプルを確認してください。上顎第一大臼歯の遠位前庭根の関心領域(ROI)を、不規則な解剖学的関心領域を手動で描画する方法を使用して選択します。次のパラメータを測定します:根のミネラル密度(RMD; g / cm³)と総体積あたりの根の体積の割合(RV / TV; %)。この測定には、適切なマイクロCTアナライザーソフトウェアと3D容積測定ツールをご利用ください^16,21.
7. Mimicsソフトウェアを使用して上顎第一大臼歯の再建を行い、得られたデータを分析して、実験モデル^16,21のOTMおよびOIIRRに関する結論を導き出します。

結果

このプロトコルにより、NiTiコイルスプリングを使用したOTMマウスモデルの調査が可能になります。0.35Nの力が加えられた場合、制御側の第1大臼歯と第2大臼歯の間の平均CEJ距離は243.69μm(図1A、線A)でしたが、OTM側では284.66μm(図1A、線B)で測定されました。OTM側と制御側の差は40.97μm でした(図1B)。右上顎骨(OTM側)と?...

ディスカッション

ここでは、OTM中の骨リモデリングの根底にある細胞および分子メカニズムを解明するために設計された標準化されたプロトコルについて説明します。マウスにおけるこれらのメカニズムを完全に理解するには、精度^{と信頼性を確保する}ための綿密に計画されたプロトコルが必要である^7,11。私たちの研究グループが実施した研究では、このプロトコ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1
Distal cut pliers	Quinelato	QO.700.00
Dynamometer	SHIMPO	FGE-5XY
Fiber Optic Illuminator	Cole-Parmer	N/A
ketamine	Syntec	100477-72-3
NiTi open-coil spring 0.25 x 0.76	Lancer Orthodontics
Ø 0.20 mm round chrome-nickel (CrNi)	Morelli	55.01.208
Round CrNi Hard Elastic Orthodontic Wire Ø0.50 mm (.020 inch)	Morelli	55.01.050
Round CrNi Tie Wire Ø0.20 mm (.008 inch)	Morelli	55.01.208
Stereomicroscope	Quimis	Q7740SZ
Transbond Plus Self Etching Primer	3M	LE-Q100-1004-7
Weingart Plier	Quinelato	QO.120.00
Xylazine	Syntec	23076-35-9
MicroCT Analysis
Skyscan 1174v2	Bruker	1174v2
Software
NRecon	Skyscan	N/A
DataViewer	Skyscan	N/A
CTAn	Skyscan	N/A
Mimics	Materialise	N/A