使用 Histoflow 流式细胞术生成和分析高参数组织学图像

Summary

这里描述的是一种可用于通过免疫荧光显微镜对五个或更多荧光参数进行成像的方法。概述了从这些图像中提取单细胞并通过类似流式细胞术的门控策略进行单细胞分析的分析管道，该管道可以识别组织切片中的细胞亚群。

Abstract

使用组织学来研究组织切片（例如来自中枢神经系统 （CNS） 的组织切片）中的免疫细胞多样性受到一次可以成像的荧光参数数量的严重限制。大多数免疫细胞亚群是使用流式细胞术通过使用蛋白质标志物的复杂组合来定义的，通常需要四个或更多参数才能最终识别，这超出了大多数传统显微镜的能力。由于流式细胞术会解离组织并丢失空间信息，因此需要能够在询问复杂细胞类型的作用的同时保留空间信息的技术。这些问题在这里通过创建一种方法来解决，该方法通过收集光谱重叠荧光团的信号并使用光谱解混来分离每个单独荧光团的信号来扩展可以成像的荧光参数的数量。然后使用分析管道处理这些图像，以拍摄高参数组织学图像并从这些图像中提取单细胞，以便可以在单细胞水平上分析每个细胞的独特荧光特性。然后，使用类似流式细胞术的设门策略，可以将细胞分析成亚群并定位回组织学切片，不仅可以量化它们的丰度，还可以确定它们如何与组织环境相互作用。总体而言，证明了使用组织流式细胞术在组织学切片中研究复杂免疫群体的简单性和潜力。

Introduction

由免疫系统细胞和神经胶质细胞驱动的炎症会导致 CNS 的慢性疾病，其中每个群体都可以促进其他群体的活动 ^1,2,3。了解免疫系统如何与 CNS 的这些元素相互作用以促进 CNS 炎症是目前感兴趣的主要话题，并且单细胞 RNA 测序等高参数技术极大地促进了这一主题。通过单细胞 RNA 测序，我们发现在几种 CNS 疾病中，神经胶质细胞和免疫系统之间存在广泛的通信 ^4,5,6。了解这些相互作用如何影响这些疾病对于阐明这些疾病的生物学至关重要。

单细胞测序分析的一个问题是，这些技术需要破坏组织以获得单细胞或细胞核，从而导致空间信息的完全丢失。了解细胞在组织中的位置对于了解细胞在驱动炎症中的作用至关重要。例如，B 细胞等免疫细胞在神经炎症期间可以集中在 CNS 中;然而，它们很少进入 CNS 薄壁组织，而是集中在 CNS 屏障⁷。鉴于它们的定位，这些细胞不太可能通过与 CNS 薄壁细胞中的神经胶质细胞发生物理相互作用来促进 CNS 炎症，这表明它们可能与神经胶质细胞发....

Protocol

该方案不包括用于组织学的组织切片;请参阅 Jain 等人 ¹⁸ 或¹⁹ 有关如何为组织学切片的描述。该方案可用于载玻片上的任何切片组织。本文使用从免疫动物中分离的腹股沟淋巴结，如前所述¹⁸。该协议的程序和时间表总结在 图 1 中。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

Discussion

这里描述了组织流式细胞术的使用，这种技术之前已经验证了¹⁸.结果表明，当使用光谱重叠染料对组织切片进行染色时，可以使用光谱补偿去除跨通道的渗漏，从而比通常通过传统方法清晰分辨更多的荧光参数。由于使用传统方法难以分析高参数组织学图像，因此提供了一个分析管道来从这些图像中分割单个细胞。通过导出这些单个细胞的荧光特征，证明像在流式细胞术中进行?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Ethanol	Sigma	676829-1L
4% PFA	Electron Microscopy Sciences	157-4
Anaconda	N/A	N/A	https://www.anaconda.com/download
Bovine Serum Albumin	Sigma	A4503-50G
Cold fish stain gelatin	Sigma	G7765
Collating multichannel data from Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Donkey anti-rat Alexa Fluor 647	JacksonImmunoResearch	712-605-153	1:300 concentration
Donkey anti-rat DyLight 405	Jackson ImmunoResearch	712-475-153	1:200 concentration
Donkey Serum	JacksonImmunoResearch	017-000-001
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710	Thermofisher	46-4010-82	1:25 concentration
FIJI	N/A	N/A	https://imagej.net/software/fiji/
FlowJo	FlowJo LLC		Software 4
Fluorescence spectraviewer			https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Fresh frozen human tonsil sections	amsbio	HF-707
Glass coverslip	VWR	48393 106
Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488	JacksonImmunoResearch	109-546-011	1:400 concentration
Goat anti-human IgG Cy3	JacksonImmunoResearch	709-166-098	1:400 concentration
Goat anti-human IgM Dylight 405	JacksonImmunoResearch	109-476-129	1:300 concentration
Goat anti-rabbit A546	Thermo Fisher Scientific	A-11035	1:250 concentration
Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610	Thermofisher	A-20981	1:250 concentration
Horse Serum	Sigma	H1138
Ilastik	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/
Ilastik FIJI plugin	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin
Imaris File Converter	Oxford Instruments		Software 2
Imaris with cell module	Oxford Instruments		Software 3
kimwipe	Kimtech	34155
LasX Life Science software	Leica		Software 1
Mouse anti-human CD20	VWR	CA95024-322	1:40 concentration
Mouse anti-human CD38 APC-R700	BD Biosciences	564980	1:20 concentration
Normal Goat Serum	JacksonImmunoResearch	005-000-001
Normal Mouse Serum	JacksonImmunoResearch	015-000-001
Normal Rabbit Serum	JacksonImmunoResearch	011-000-001
Normal Rat Serum	JacksonImmunoResearch	012-000-120
Nuclear Yellow	Abcam	ab138903	Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark
PAP pen	Cedarlane	MU22
PBS	Gibco	10010-023
Rabbit anti-human Ki67	Abcam	ab15580	1:500 concentration
Rabbit anti-mouse Iba1	Wako	019-19741	1:500 concentration
Rat anti-human Blimp1	Thermofisher	14-5963-82	1:40 concentration
Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647	BioLegend	103226	1:250 concentration
Rat anti-mouse CD138	Biolegend	142502	1:200 concentration
Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610	Thermo Fisher Scientific	61-0032-82	1:40 concentration
Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488	BioLegend	100529	1:200 concentration
Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700	BD Biosciences	565478	1:50 concentration
Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710	Thermo Fisher Scientific	46-5993-82	1:50 concentration
SP8 Confocal microscope	Leica
Triton X-100	Sigma	X100-500ml
Trueblack	Biotium	23007
Tween-20	Sigma	P7949-500ml
Ultracomp ebeads	Thermofisher	01-2222-42