מיצוי משופר של DNA במשקל מולקולרי נמוך משפכים להערכה מקיפה של עמידות מיקרוביאלית

Summary

כאן, אנו מציגים טכניקה פשוטה להערכת עמידות אנטי-מיקרוביאלית סביבתית (AMR) על-ידי שיפור שיעור הדנ"א החוץ תאי בעל משקל מולקולרי נמוך. טיפול קודם עם 20%-30% PEG ו-1.2 M NaCl מאפשר זיהוי של גנים AMR גנומיים ואופקיים. הפרוטוקול משאיל את עצמו לתהליך ללא ערכה עם אופטימיזציה נוספת.

Abstract

מעקב סביבתי מוכר ככלי חשוב להערכת בריאות הציבור בעידן שלאחר המגפה. מים, במיוחד שפכים, התגלו כמקור הבחירה לדגום עומסים פתוגניים בסביבה. שפכים מנקז פתוח וממתקני טיהור מים קהילתיים הם מאגר של פתוגנים וגנים של עמידות מיקרוביאלית (AMR), ולעתים קרובות באים במגע עם בני אדם. בעוד שישנן שיטות רבות למעקב אחר AMR ממים, בידוד DNA באיכות טובה בתפוקות גבוהות מדגימות הטרוגניות נותר אתגר. כדי לפצות, נפחי הדגימה צריכים לעתים קרובות להיות גבוהים, מה שיוצר אילוצים מעשיים. בנוסף, דנ"א סביבתי הוא לעתים קרובות מקוטע, והמקורות של AMR (פלסמידים, פאגים, דנ"א ליניארי) מורכבים מדנ"א במשקל מולקולרי נמוך. עם זאת, תהליכי מיצוי מעטים התמקדו בשיטות למיצוי בתפוקה גבוהה של DNA ליניארי ובעל משקל מולקולרי נמוך. כאן, שיטה פשוטה למיצוי DNA ליניארי בעל תפוקה גבוהה מכמויות קטנות של שפכים באמצעות תכונות המשקעים של פוליאתילן גליקול (PEG) מדווחת. מחקר זה מציג טיעון להגדלת תפוקת הדנ"א הכוללת מדגימות מים שנאספו לצורך ניתוח מטאגנומי על ידי העשרת שיעור הדנ"א הלינארי. בנוסף, שיפור DNA במשקל מולקולרי נמוך מתגבר על הבעיה הנוכחית של תת-דגימה של AMR סביבתי עקב התמקדות בדנ"א בעל משקל מולקולרי גבוה ותוך תאי. שיטה זו צפויה להיות שימושית במיוחד כאשר קיים דנ"א חוץ-תאי אך בריכוזים נמוכים, כגון עם קולחים ממתקני טיהור. זה אמור גם לשפר את הדגימה הסביבתית של מקטעי גנים AMR המתפשטים באמצעות העברת גנים אופקית.

Introduction

SARS-CoV-2 ותוצאותיו הדגישו את חשיבות המעקב הסביבתי בניטור וחיזוי התפרצויות מחלות זיהומיות ^1,2. בעוד שמגפות ויראליות ניכרות, עליית העמידות האנטי-מיקרוביאלית (AMR) מתוארת לעתים קרובות כמגיפה חתרנית וכזו המהווה דאגה מובילה לבריאות הציבור ברחבי העולם ^3,4. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף באסטרטגיות מתואמות כדי להבין את האבולוציה וההתפשטות של AMR. גופי מים, כמו גם שפכים, יכולים לשמש כמאגרים הן לפתוגנים והן ל- AMR 5,6,7,8. מקורות מים משות....

Protocol

1. דיגום שפכים

1. טבלו פוליפרופילן בנפח 500 מ"ל במאגר הניקוז הפתוח או במתקן טיהור השפכים (STP) ואספו ~300 מ"ל של דגימת שפכים.
2. העבר ~ 250 מ"ל של הדגימה לבקבוק פוליפרופילן אוטוקלאבד 250 מ"ל.
3. הבריגו את פקק הבקבוק ואטמו אותו בסרט פלסטיק. שמרו את הבקבוק זקוף בשקית סגורה.
4. העבירו את.......

Discussion

AMR הוא אחד מעשרת האיומים הבריאותיים המובילים כיום, כפי שצוין על ידי ארגון הבריאות העולמי, ומעקב סביבתי אחר AMR מוכר ככלי חשוב ברחבי העולם. כפי שהוזכר במבוא, תיעוד מקיף של AMR סביבתי כולל דנ"א בעל משקל מולקולרי נמוך, מקוטע וחוץ-תאי. פרוטוקול העיבוד המקדים שדווח כאן באמצעות ריכוז גבוה של PEG בשילוב.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-seat microcentrifuge	Eppendorf Centrifuge 5425 R	EP5406000046
Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Ethanol absolute for analysis)	Supelco	100983-0511
Agarose	Invitrogen	16500500
Bench top refrigerated centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5920 R	EP5948000131
ChemiDoc Imaging System	BioRad	12003153
DNeasy PowerSoil Pro Kit	Qiagen	47014
DNeasy PowerWater Pro Kit	Qiagen	14900-100-NF
dNTPs (dNTP Mix 10mM Each,0.2 mL, R0191)	Thermo Fisher	R0191
DreamTaq DNA Polymerase, 5 U/µL + 10x DreamTaq Buffer*	Thermofscientific	EP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder	Invitrogen	10488091
Maxiamp PCR tubes 0.2 mL	Tarsons	510051
Molecular Biology Grade Water for PCR	HiMedia	ML065-1.5ML
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	13400519
Parafilm	Bemis	S37440
PEG-8000	SRL	54866
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit	Qiagen	28506
Qubit 4 Fluorometer (with WiFi)	Thermofisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermofisher	Q32856
Qubitt reagent kit for ds DNA, broad range	Thermo Scientific	Q32853 (500 assays)
Sodium Chloride	HiMedia	TC046M-500G
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-well PCR System)	Applied Biosystems	4484073
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1125