Exame de piroptose por citometria de fluxo

Summary

Este artigo descreve a identificação de células piroptóticas usando citometria de fluxo após coloração dupla com anticorpos contra o fragmento N-terminal de GSDME de frango (chGSDME-NT⁾ e iodeto de propídio (PI).

Abstract

A piroptose é um tipo inflamatório de morte celular programada predominantemente impulsionada pela formação de poros da membrana plasmática pelo terminal N gerado a partir das proteínas da família Gasdermin clivada (GSDM). O exame de GSDM-NT ligado à membrana por Western Blot é o método mais comumente usado para avaliar a piroptose. No entanto, é difícil diferenciar células com piroptose de outras formas de morte celular usando este método. Neste estudo, células DF-1 infectadas pelo Vírus da Doença Infecciosa da Bursa (IBDV) foram empregadas como modelo para quantificar a proporção de células submetidas à piroptose por citometria de fluxo, utilizando anticorpos específicos contra o fragmento N-terminal da coloração GSDME de galinha (chGSDME-NT⁾ e iodeto de propídio (PI). As células chGSDME-NT-positivas foram prontamente detectáveis por citometria de fluxo usando anticorpos anti-chGSDME-NT marcados com Alexa Fluor 647. Além disso, a proporção de células chGSDME-NT / PI duplamente positivas em células infectadas por IBDV (cerca de 33%) foi significativamente maior do que em controles infectados simulados (P < 0,001). Esses achados indicam que o exame de chGSDME-NT ligado à membrana por citometria de fluxo é uma abordagem eficaz para determinar células piroptóticas entre células submetidas à morte celular.

Introduction

A piroptose é um tipo inflamatório de morte celular programada que depende principalmente da formação de poros da membrana plasmática pela Gasdermin (GSDM) D em mamíferos ^1,2,3. Devido à deficiência genética de GSDMD em galinhas ^4,5, o mecanismo de piroptose em galinhas permanece indefinido. A família Gasdermin compreende proteínas conservadas, incluindo GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME e DFNB59 ^3,6. Estudos relataram que o GSDME de peixes teleósteos e patos ....

Protocol

Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de amostras de células

1. Cultura de células DF-1 (fibroblastos de embrião de galinha imortal) em placas de seis poços (5 x 10,⁵ células por poço) com Meio de Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em uma incubadora de 5% de CO₂ a 38 °C.
2. Quando as célul.......

Discussion

Este artigo descreve um método eficaz para examinar a piroptose usando citometria de fluxo, obtida por meio da coloração dupla de células infectadas com Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT McAb e PI. Essa abordagem também pode ser aplicada em vários tipos de células para diferenciar a piroptose de outros tipos de morte celular, como apoptose e necrose.

A piroptose, um tipo inflamatório de morte celular programada dependente principalmente da formação de poros da membrana plasm.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm)	Corning Falcon	352052
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Alexa Fluor 647 antibody labeling kits	Thermo Fisher Scientific	A20186
Anti-chGSDME-CT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0228
Anti-chGSDME-NT McAb	SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)	EU0227
CellQuest software	BD Biosciences
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	3100
Cryogenic Freezing Centrifuge	Eppendorf	5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0193-500ML
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Cytometry Staining Buffer	Thermo Fisher Scientific	00-4222-26
Hemocytometer	Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China)	YX-JSB52
IBDV Lx strain			IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China
Inverted Microscope	Chongqing Photoelectric Instrument Company	XDS-1B
Normal Mouse IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Phosphate Buffer Saline (PBS)	M&C  Gene Technology	CC017
Propidium Iodide(PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Trypsin-EDTA, 0.25%	M&C  Gene Technology	CC008
Vortex Oscillator	MIULAB	MIX-28+