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Este artigo descreve a identificação de células piroptóticas usando citometria de fluxo após coloração dupla com anticorpos contra o fragmento N-terminal de GSDME de frango (chGSDME-NT) e iodeto de propídio (PI).
A piroptose é um tipo inflamatório de morte celular programada predominantemente impulsionada pela formação de poros da membrana plasmática pelo terminal N gerado a partir das proteínas da família Gasdermin clivada (GSDM). O exame de GSDM-NT ligado à membrana por Western Blot é o método mais comumente usado para avaliar a piroptose. No entanto, é difícil diferenciar células com piroptose de outras formas de morte celular usando este método. Neste estudo, células DF-1 infectadas pelo Vírus da Doença Infecciosa da Bursa (IBDV) foram empregadas como modelo para quantificar a proporção de células submetidas à piroptose por citometria de fluxo, utilizando anticorpos específicos contra o fragmento N-terminal da coloração GSDME de galinha (chGSDME-NT) e iodeto de propídio (PI). As células chGSDME-NT-positivas foram prontamente detectáveis por citometria de fluxo usando anticorpos anti-chGSDME-NT marcados com Alexa Fluor 647. Além disso, a proporção de células chGSDME-NT / PI duplamente positivas em células infectadas por IBDV (cerca de 33%) foi significativamente maior do que em controles infectados simulados (P < 0,001). Esses achados indicam que o exame de chGSDME-NT ligado à membrana por citometria de fluxo é uma abordagem eficaz para determinar células piroptóticas entre células submetidas à morte celular.
A piroptose é um tipo inflamatório de morte celular programada que depende principalmente da formação de poros da membrana plasmática pela Gasdermin (GSDM) D em mamíferos 1,2,3. Devido à deficiência genética de GSDMD em galinhas 4,5, o mecanismo de piroptose em galinhas permanece indefinido. A família Gasdermin compreende proteínas conservadas, incluindo GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME e DFNB59 3,6. Estudos relataram que o GSDME de peixes teleósteos e patos ....
Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de amostras de células
chGSDME-NT na membrana de células DF-1 com infecção por IBDV pode ser prontamente detectado por citometria de fluxo
Uma das características mais importantes das células piroptóticas é a formação de poros de membrana por fragmentos de GSDM-NT gerados a partir da clivagem de Gasdermin. Portanto, as células piroptóticas poderiam teoricamente ser detectadas por citometria de fluxo por meio do exame de GSDM-NT em membranas celulares usando anticorpos específicos.<.......
Este artigo descreve um método eficaz para examinar a piroptose usando citometria de fluxo, obtida por meio da coloração dupla de células infectadas com Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT McAb e PI. Essa abordagem também pode ser aplicada em vários tipos de células para diferenciar a piroptose de outros tipos de morte celular, como apoptose e necrose.
A piroptose, um tipo inflamatório de morte celular programada dependente principalmente da formação de poros da membrana plasm.......
Os autores não têm nada a divulgar.
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Jue Liu por sua gentil assistência. Este estudo foi apoiado por doações do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (nº 2022YFD1800300), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 32130105) e do Fundo Destinado ao Sistema de Pesquisa Tecnológica da Agroindústria Moderna (nº. CARS-40), China.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
Alexa Fluor 647 antibody labeling kits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
CellQuest software | BD Biosciences | ||
CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
Cryogenic Freezing Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
Flow Cytometry Staining Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
Hemocytometer | Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
IBDV Lx strain | IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
Inverted Microscope | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
Normal Mouse IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | M&C Gene Technology | CC017 | |
Propidium Iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
Trypsin-EDTA, 0.25% | M&C Gene Technology | CC008 | |
Vortex Oscillator | MIULAB | MIX-28+ |
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