Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В данной статье описана идентификация пироптотических клеток с помощью проточной цитометрии после двойного окрашивания антителами против N-концевого фрагмента куриного GSDME (chGSDME-NT) и йодида пропидия (PI).

Abstract

Пироптоз — это воспалительный тип запрограммированной гибели клеток, вызванный преимущественно образованием пор плазматической мембраны N-концом, образованным из расщепленных белков семейства Gasdermin (GSDM). Исследование прикрепленного к мембране GSDM-NT методом вестерн-блоттинга является наиболее часто используемым методом оценки пироптоза. Однако дифференцировать клетки с пироптозом от других форм клеточной гибели с помощью этого метода сложно. В этом исследовании клетки DF-1, инфицированные вирусом инфекционной бурсальной болезни (IBDV), были использованы в качестве модели для количественной оценки доли клеток, подвергающихся пироптозу, с помощью проточной цитометрии с использованием специфических антител против N-концевого фрагмента куриного GSDME (chGSDME-NT) и окрашивания йодидом пропидия (PI). ChGSDME-NT-положительные клетки были легко обнаруживаемы с помощью проточной цитометрии с использованием меченых Alexa Fluor 647 антител против chGSDME-NT. Более того, доля двойных положительных клеток chGSDME-NT/PI в клетках, инфицированных IBDV (около 33%), была значительно выше, чем в контрольной группе с фиктивным инфицированием (P < 0,001). Эти результаты указывают на то, что исследование мембраносвязанного chGSDME-NT с помощью проточной цитометрии является эффективным подходом для определения пироптотических клеток среди клеток, подвергающихся клеточной гибели.

Introduction

Пироптоз является воспалительным типом запрограммированной гибели клеток, который в основном зависит от образования пор плазматической мембраны газдермином (GSDM) D у млекопитающих 1,2,3. Из-за генетической недостаточности GSDMD у цыплят 4,5 механизм пироптоза у цыплят остается неуловимым. Семейство Gasdermin включает консервативные белки, включая GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME и DFNB59 3,6. Исследования показали, что GSDME из костистых рыб и уток расщепляе....

Protocol

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка образцов ячеек

  1. Культивирование клеток DF-1 (бессмертных фибробластов куриного эмбриона) в шестилуночных планшетах (5 x 10.......

Representative Results

chGSDME-NT на мембране клеток DF-1 с инфекцией IBDV может быть легко обнаружен с помощью проточной цитометрии
Одной из наиболее важных особенностей пироптотических клеток является образование мембранных пор фрагментами GSDM-NT, образующимися в результате расщепления Gasdermin.......

Discussion

В данной статье описан эффективный метод исследования пироптоза с помощью проточной цитометрии, полученный путем двойного окрашивания инфицированных клеток мечеными Alexa Fluor 647 анти-chGSDME-NT McAb и PI. Этот подход также может быть применен к различным типам клеток для дифференциации пи?.......

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить доктора Цзюэ Лю за его любезную помощь. Данное исследование было поддержано грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (No 2022YFD1800300), Национального фонда естественных наук Китая (No 32130105) и Целевого фонда современной системы исследований в области агропромышленных технологий (No 2022YFD1800300), Национального фонда естественных наук Китая (No ) и Целевого фонда современной системы исследований в области агропромышленных технологий (No 2022YFD1800300). CARS-40), Китай.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm)Corning Falcon352052
6 Well Cell Culture PlateCorning3516
Alexa Fluor 647 antibody labeling kitsThermo Fisher ScientificA20186
Anti-chGSDME-CT McAbSAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)EU0228
Anti-chGSDME-NT McAbSAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)EU0227
CellQuest softwareBD Biosciences
CO2 incubatorThermo Fisher Scientific3100
Cryogenic Freezing CentrifugeEppendorf5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco by Life TechnologiesC11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF0193-500ML
Flow CytometerBD BiosciencesFACSCalibur
Flow Cytometry Staining BufferThermo Fisher Scientific00-4222-26
HemocytometerQiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China)YX-JSB52
IBDV Lx strainIBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China
Inverted MicroscopeChongqing Photoelectric Instrument CompanyXDS-1B
Normal Mouse IgGSanta Cruz Biotechnologysc-2025
Phosphate Buffer Saline (PBS)M&C  Gene TechnologyCC017
Propidium Iodide(PI)Sigma-AldrichP4170
Trypsin-EDTA, 0.25%M&C  Gene TechnologyCC008
Vortex OscillatorMIULABMIX-28+

References

  1. He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
  2. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Ga....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

IBDVDF 1ChGSDME NT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved