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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

视网膜色素上皮 (RPE) 是脉络膜和视网膜之间的重要屏障,促进视网膜细胞类型(如光感受器)的健康和功能。在此,我们描述了一种简单有效的分离和培养成年小鼠 RPE 的方案。

Abstract

视网膜色素上皮细胞 (RPE) 对于视网膜的正常功能至关重要。RPE 功能障碍参与重要视网膜疾病的发病机制,例如年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎和糖尿病性视网膜病变。我们提出了一种从小鼠成人眼中分离 RPE 的简化方法。与以前报道的方法相比,这种方法能够从成年小鼠中分离和培养高纯度 RPE。这种简单快速的方法不需要广泛的技术技能,并且可以通过基本的科学工具和试剂来实现。通过摘除眼睛,然后去除眼前节,从 3 至 14 周龄的 C57BL/6 背景小鼠中分离出原发性 RPE。酶促胰蛋白酶消化和离心用于从眼罩中解离和分离 RPE。总之,这种方法为 RPE 在视网膜功能和疾病研究中的使用提供了一种快速有效的方案。

Introduction

视网膜色素上皮 (RPE) 是位于 Bruch 膜上的一种特殊细胞单层,位于光感受器和脉络膜1 之间。RPE 细胞在视网膜的正常功能中起着关键作用。RPE 细胞将葡萄糖和维生素 A 运输到光感受器,通过将全反式视网膜再异构化为 11-顺式视网膜来促进视力,并通过吞噬脱落的外段来维持光感受器的外段,从视网膜下空间去除水分,通过紧密连接的存在形成外血视网膜屏障并分泌嗜神经性生长因子(如色素上皮衍生因子、 和碱性成纤维细胞生长因子)支持光感受器2。RPE 细胞功能障碍参与各种视网膜病变的发病机制,包括年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎和糖尿病性视网膜病变 3,4,5。使用 RPE 细胞的体外研究对于提高我们对这些疾病发病机制的理解至关重要。原代 RPE 细胞是这些研究的首选,因为 RPE 细胞系虽然很容易获得,但缺乏原代 RPE 细胞的关键特征。

虽然各种物种已被用作原代 RPE 细胞的来源,但小鼠具有使用基因修饰来帮助了解视网膜病变发病机制的优势。先前描述的从啮齿动物中分离 RPE 细胞的方案要么需要使用新生动物,要么冗长,需要技术技能,要么不适合培养<....

Protocol

本研究中动物受试者的使用得到了凯斯西储大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。

1. 试剂制备

  1. 通过补充 Hank 平衡盐溶液 (HBSS)、无钙、无镁、无酚红和 10 mM HEPES 缓冲溶液来制备洗涤缓冲液。将溶液保持在 4 °C 直至使用。
  2. 通过在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基中补充 4.5 g/L 葡萄糖、1.25x GlutaMAX 补充剂(储备液浓度 100 倍或 200 mM;终浓度为 2.5 m.......

Representative Results

所述方案已用于 C57BL/6 背景小鼠。性别似乎并没有改变培养 RPE 的能力。与老年小鼠相比,6 周以下的小鼠产生的 RPE 片有限,可能需要更多的眼睛才能达到最佳汇合。分离后,RPE 细胞大约需要 3 天才能稳定并附着在细胞培养板上。分离后约 24 小时,看起来无核的圆形色素沉着细胞已经开始沉降,但尚未完全粘附在板上(图 1A)。在接下来的 48-72 小时内,细胞开始附着和扩?.......

Discussion

在本文中,我们概述了一种分离和培养小鼠视网膜色素上皮的简化方案。从成年小鼠的眼睛中分离的 RPE 细胞表达 RPE 特异性标志物 RPE65 和细胞间连接标志物 ZO-1。此外,培养的细胞在培养物中发育成有色的六边形片材。

之前已经发表了几种在啮齿动物中分离 RPE 的方法6789<.......

Acknowledgements

本出版物中报告的研究得到了 NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (CSS)、NIH Grant F31EY035156 (AH) 和 P30 EY011373 的支持。资助组织在这项研究的设计或实施中没有任何作用。

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.009 RD Single-Edge BladesPersonna941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning10-013-CVwith 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serumCorning35010CV
GlutaMAX, 100xGibco35050061
Hank's Balanced Salt SolutionGibco14175095no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)Gibco15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100xGibco11140050
Micro-Unitome KnifeBVI Beaver377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100xCorning30-002-CI
Polystyrene MicroplatesFalcon08-772-124-well or 48-well
Regular Fetal Bovine SerumCorning35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)Gibco25200056with phenol red
Vannas scissorsFine Science Tools10091-12

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Prog Retin Eye Res. 100846, (20....

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