Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

O epitélio pigmentar da retina (EPR) atua como uma barreira crucial entre a coróide e a retina, promovendo a saúde e a função dos tipos de células da retina, como os fotorreceptores. Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para isolar e cultivar EPR murino adulto.

Abstract

As células epiteliais pigmentares da retina (EPR) são críticas para o funcionamento adequado da retina. A disfunção do EPR está envolvida na patogênese de doenças retinianas importantes, como degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa e retinopatia diabética. Apresentamos uma abordagem simplificada para o isolamento de EPR de olhos adultos murinos. Em contraste com os métodos relatados anteriormente, essa abordagem permite o isolamento e a cultura de EPR altamente puro de camundongos adultos. Este método simples e rápido não requer muita habilidade técnica e é alcançável com ferramentas e reagentes científicos básicos. Os EPR primários são isolados de camundongos de fundo C57BL/6 com idade entre 3 e 14 semanas por enucleação do olho seguida pela remoção do segmento anterior. A tripsinização enzimática e a centrifugação são usadas para dissociar e isolar o EPR da ocular. Em conclusão, essa abordagem oferece um protocolo rápido e eficaz para a utilização do EPR no estudo da função e doença da retina.

Introduction

O epitélio pigmentar da retina (EPR) é uma monocamada celular especializada que reveste a membrana de Bruch localizada entre os fotorreceptores e a coróide1. As células RPE desempenham um papel crítico no funcionamento adequado da retina. As células RPE transportam glicose e vitamina A para os fotorreceptores, promovem a visão por re-isomerização de all-trans retinal em 11-cis retinal e mantêm segmentos externos do fotorreceptor através da fagocitose de segmentos externos derramados, removem a água do espaço sub-retiniano, formam a barreira hemato-retiniana externa através da presença de junções apertadas e secretam fatores de crescimento neuro....

Protocol

O uso de animais neste estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Case Western Reserve University.

1. Preparação de reagentes

  1. Prepare o meio tampão de lavagem suplementando a solução salina balanceada de Hank (HBSS), sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol com solução tampão HEPES 10 mM. Manter a solução a 4 °C até à utilização.
  2. Prepare o meio RPE suplementando o meio de Eagle modificado d.......

Representative Results

O protocolo descrito foi usado em camundongos de fundo C57BL / 6. O gênero não parece alterar a capacidade de cultivar EPR. Camundongos com menos de 6 semanas produzem folhas de EPR limitadas em comparação com camundongos mais velhos, e mais olhos podem ser necessários para alcançar a confluência ideal. Após o isolamento, as células RPE levam cerca de 3 dias para se estabilizar e se ligar à placa de cultura de células. Aproximadamente 24 h após o isolamento, células redondas e pigmentadas que parecem anuclea.......

Discussion

Neste artigo, descrevemos um protocolo simplificado para o isolamento e cultura do epitélio pigmentar da retina murina. As células RPE isoladas dos olhos de camundongos adultos expressaram um marcador específico de RPE, RPE65, e um marcador de junção intercelular, ZO-1. Além disso, as células cultivadas se desenvolveram em folhas hexagonais pigmentadas em cultura.

Vários métodos para isolamento de EPR em roedores foram publicados anteriormente 6,7,8,.......

Acknowledgements

A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (CSS), NIH Grant F31EY035156 (AH) e P30 EY011373. A organização financiadora não teve nenhum papel no desenho ou condução desta pesquisa.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.009 RD Single-Edge BladesPersonna941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning10-013-CVwith 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serumCorning35010CV
GlutaMAX, 100xGibco35050061
Hank's Balanced Salt SolutionGibco14175095no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)Gibco15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100xGibco11140050
Micro-Unitome KnifeBVI Beaver377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100xCorning30-002-CI
Polystyrene MicroplatesFalcon08-772-124-well or 48-well
Regular Fetal Bovine SerumCorning35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)Gibco25200056with phenol red
Vannas scissorsFine Science Tools10091-12

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Prog Retin Eye Res. 100846, (20....

Explore More Articles

C lulas epiteliais pigmentares da retinaisolamento de EPRcultura de EPREPR de camundongo adultodoen a da retinadegenera o macular relacionada idaderetinite pigmentosaretinopatia diab tica

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved