Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Summary

O epitélio pigmentar da retina (EPR) atua como uma barreira crucial entre a coróide e a retina, promovendo a saúde e a função dos tipos de células da retina, como os fotorreceptores. Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para isolar e cultivar EPR murino adulto.

Abstract

As células epiteliais pigmentares da retina (EPR) são críticas para o funcionamento adequado da retina. A disfunção do EPR está envolvida na patogênese de doenças retinianas importantes, como degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa e retinopatia diabética. Apresentamos uma abordagem simplificada para o isolamento de EPR de olhos adultos murinos. Em contraste com os métodos relatados anteriormente, essa abordagem permite o isolamento e a cultura de EPR altamente puro de camundongos adultos. Este método simples e rápido não requer muita habilidade técnica e é alcançável com ferramentas e reagentes científicos básicos. Os EPR primários são isolados de camundongos de fundo C57BL/6 com idade entre 3 e 14 semanas por enucleação do olho seguida pela remoção do segmento anterior. A tripsinização enzimática e a centrifugação são usadas para dissociar e isolar o EPR da ocular. Em conclusão, essa abordagem oferece um protocolo rápido e eficaz para a utilização do EPR no estudo da função e doença da retina.

Introduction

O epitélio pigmentar da retina (EPR) é uma monocamada celular especializada que reveste a membrana de Bruch localizada entre os fotorreceptores e a coróide¹. As células RPE desempenham um papel crítico no funcionamento adequado da retina. As células RPE transportam glicose e vitamina A para os fotorreceptores, promovem a visão por re-isomerização de all-trans retinal em 11-cis retinal e mantêm segmentos externos do fotorreceptor através da fagocitose de segmentos externos derramados, removem a água do espaço sub-retiniano, formam a barreira hemato-retiniana externa através da presença de junções apertadas e secretam fatores de crescimento neuro....

Protocol

O uso de animais neste estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Case Western Reserve University.

1. Preparação de reagentes

1. Prepare o meio tampão de lavagem suplementando a solução salina balanceada de Hank (HBSS), sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol com solução tampão HEPES 10 mM. Manter a solução a 4 °C até à utilização.
2. Prepare o meio RPE suplementando o meio de Eagle modificado d.......

Discussion

Neste artigo, descrevemos um protocolo simplificado para o isolamento e cultura do epitélio pigmentar da retina murina. As células RPE isoladas dos olhos de camundongos adultos expressaram um marcador específico de RPE, RPE65, e um marcador de junção intercelular, ZO-1. Além disso, as células cultivadas se desenvolveram em folhas hexagonais pigmentadas em cultura.

Vários métodos para isolamento de EPR em roedores foram publicados anteriormente 6,7,8,.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.009 RD Single-Edge Blades	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175095	no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Polystyrene Microplates	Falcon	08-772-1	24-well or 48-well
Regular Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	with phenol red
Vannas scissors	Fine Science Tools	10091-12