Uma abordagem para a construção de comunidades de biofilme multiespécies a partir do solo da rizosfera

Summary

Um procedimento rápido e padronizado para estabelecer comunidades sinérgicas de biofilmes multiespécies de vários solos da rizosfera é apresentado aqui. É um protocolo único projetado para sondar e simular a complexa microbiota do solo da rizosfera.

Abstract

O biofilme multiespécie é um estilo de vida natural e dominante de bactérias na natureza, inclusive no solo da rizosfera, embora a compreensão atual seja limitada. Aqui, fornecemos uma abordagem para estabelecer rapidamente comunidades sinérgicas de biofilmes multiespécies. O primeiro passo é extrair células do solo da rizosfera usando o método de centrifugação diferencial. Posteriormente, essas células do solo são inoculadas no meio de cultura para formar biofilme de película. Após 36 h de incubação, a composição bacteriana do biofilme e a solução abaixo são determinadas usando o método de sequenciamento de amplicon do gene 16S rRNA. Enquanto isso, o isolamento bacteriano de alto rendimento do biofilme da película é realizado usando o método de diluição limitante. Em seguida, os 5 principais táxons bacterianos são selecionados com a maior abundância nos dados de sequenciamento do amplicon do gene 16S rRNA (amostras de biofilme da película) para uso posterior na construção de comunidades de biofilme multiespécies. Todas as combinações dos 5 táxons bacterianos foram rapidamente estabelecidas usando uma placa de 24 poços, selecionada para a maior capacidade de formação de biofilme pelo ensaio de coloração violeta de cristal e quantificada por qPCR. Finalmente, as comunidades de biofilme multiespécies bacterianas sintéticas mais robustas foram obtidas através dos métodos acima. Esta metodologia fornece orientação informativa para a realização de pesquisas sobre biofilme multiespécies da rizosfera e identificação de comunidades representativas para o estudo dos princípios que regem as interações entre essas espécies.

Introduction

Os biofilmes representam comunidades microbianas intrincadas afixadas em superfícies ou ligadas a interfaces. Há um amplo reconhecimento de que a maioria das bactérias encontradas em vários ambientes, como habitats naturais, ambientes clínicos e contextos industriais, perduram dentro de comunidades de biofilme¹. No solo, a rizosfera - abrangendo a superfície da raiz e sua região adjacente de 2 mm de espessura - forma um nicho ecológico com maior disponibilidade de nutrientes. Bactérias específicas desenvolveram estratégias para explorar esse nicho, promovendo a proliferação microbiana e promovendo a formação de comunidades de biofilme na rizosf....

Protocol

Este protocolo é geralmente aplicável à microbiota do solo rizosférico de várias plantas. Aqui, o pepino é usado como exemplo. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento bacteriano

1. Isolamento do solo da rizosfera
   1. Cultura do pepino
      1. Desinfete as sementes de pepino com etanol a 75% e solução de hipoclorito de sódio (NaClO) a 2% e enxágue-as em água estéril.......

Discussion

Seguindo o protocolo, uma série de comunidades robustas de biofilmes sintéticos multiespécies são construídas com base na microbiota no solo da rizosfera de diferentes plantas. Usando técnicas de PCR quantitativas, a composição de cada comunidade é decifrada claramente. A biomassa do biofilme indica a força de suas potenciais interações metabólicas, embora várias propriedades e mecanismos por trás da cooperação não possam ser revelados aqui¹⁹. Dado o tamanho e a complexidade das .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 % Na4P2O7 solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	20041418	Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	F613463-0001	Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	L03336903	Used to sterilize the seeds.
24-well Plate	Merck & Co., Inc.	PSRP010	Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Bioolook Scientific Research Special	2360010	Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube	Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.	62.547.254	Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	801769680	Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit	Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.	D3350020000K04U021	Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Jilin Province.
Black Soil II	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10035048	Used to prepare MSgg media.
Centrifuge	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	G508009-0001	High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix	Vazyme Biotech Co.,Ltd.	Q311-02	Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.	NB026143	Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator	ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd	GNP-9080BS-	Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	A600331	Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed	Nanjing Agricultural University	N/A	"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0	The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences	N/A	Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011918	Used to prepare MSgg media.
Fridge	Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.	BCD-556WKPM(Q)	Used for strain preservation.
Glutamate	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010618	Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket	Yulv Furniture Store	6526262626	Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10017618	Used to prepare MSgg media.
MgCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	7791186	Used to prepare MSgg media.
MnCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10400101	Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium	Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.	BES20791KB	Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O	Merck & Co., Inc.	S9390-100G	Used to prepare TSB media.
NaCI	Chinasun Specialty Products co., Ltd.	HS0416	Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O	Merck & Co., Inc.	S9638-25G	Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	E607008-0001	Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine	RYON	RT3486L005	Used to prepare MSgg media.
Pipette	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	BS-1000-T	Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.	D102A	Used to generate qPCR standard curves.
Pot	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	YHHWS2401	Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument	Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.	4484073	Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary	The Wellcome Trust SangerInstitute	N/A	Used to design primers of qPCR
Shaker	Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd	ZQTY-50S	Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77	Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.	SL77080596	Used to prepare TSB media.
Soy peptone	Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd	HB8275	Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer	Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.	76713100010	Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	SW150302	Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	223016852LLZA	Used for basic experimental operations.
Template DNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Used to prepare TSB media.
Tryptophan	Bioolook Scientific Research Special	2190020	Used to prepare MSgg media.
TSB Medium	Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.	024048	Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium	Nanjing Agricultural University	N/A	Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2	Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd	C0310520123	Used to prepare MSgg media.