Подход к построению многовидовых биопленочных сообществ из ризосферной почвы

Summary

Здесь представлена быстрая и стандартизированная процедура создания синергетических многовидовых биопленочных сообществ из различных ризосферных почв. Это уникальный протокол, предназначенный для исследования и моделирования сложной ризосферной почвенной микробиоты.

Abstract

Многовидовая биопленка является естественным и доминирующим образом жизни бактерий в природе, в том числе в ризосферной почве, хотя в настоящее время ее понимание ограничено. Здесь мы предлагаем подход к быстрому созданию синергетических многовидовых биопленочных сообществ. Первым шагом является извлечение клеток из ризосферного грунта методом дифференциального центрифугирования. После этого эти клетки почвы инокулируются в культуральную среду с образованием биопленки пленки. После 36 ч инкубации бактериальный состав биопленки и находящегося под ней раствора определяют с помощью метода секвенирования ампликонов гена 16S рРНК. Между тем, высокопроизводительное выделение бактерий из биопленки пленки проводится методом предельного разведения. Затем отбираются 5 ведущих бактериальных таксонов с наибольшей численностью в данных секвенирования ампликонов гена 16S рРНК (образцы биопленки пелликулы) для дальнейшего использования при построении многовидовых биопленочных сообществ. Все комбинации 5 бактериальных таксонов были быстро установлены с помощью 24-луночного планшета, отобраны для наиболее сильной способности к образованию биопленки с помощью анализа окрашивания кристаллическим фиолетовым цветом и количественно определены с помощью количественной ПЦР. Наконец, наиболее устойчивые синтетические бактериальные многовидовые биопленочные сообщества были получены с помощью описанных выше методов. Данная методология содержит информативные рекомендации по проведению исследований ризосферной многовидовой биопленки и выявлению репрезентативных сообществ для изучения принципов, регулирующих взаимодействие между этими видами.

Introduction

Биопленки представляют собой сложные микробные сообщества, прикрепленные к поверхностям или связанные с ними интерфейсами. Широко признано, что большинство бактерий, встречающихся в различных средах, таких как естественная среда обитания, клинические условия и промышленные контексты, сохраняются^{в биопленочных} сообществах. В почве ризосфера, охватывающая поверхность корня и прилегающую к нему область толщиной 2 мм, образует экологическую нишу с повышенной доступностью питательных веществ. Специфические бактерии разработали стратегии для использования этой ниши, способствуя размножению микробов и формированию биопленочных сообществ в

Protocol

Этот протокол в целом применим к ризосферной микробиоте почвы различных растений. Здесь в качестве примера используется огурец. Подробная информация о реактивах и оборудовании, использованных для исследования, приведена в Таблице материалов.

1. Бактериальн?.......

Discussion

В соответствии с протоколом на основе микробиоты ризосферной почвы различных растений создается ряд устойчивых синтетических многовидовых биопленочных сообществ. С помощью количественных методов ПЦР четко расшифровывается состав каждого сообщества. Биомасса биопленки указывает н?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 % Na4P2O7 solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	20041418	Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	F613463-0001	Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	L03336903	Used to sterilize the seeds.
24-well Plate	Merck & Co., Inc.	PSRP010	Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Bioolook Scientific Research Special	2360010	Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube	Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.	62.547.254	Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	801769680	Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit	Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.	D3350020000K04U021	Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Jilin Province.
Black Soil II	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10035048	Used to prepare MSgg media.
Centrifuge	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	G508009-0001	High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix	Vazyme Biotech Co.,Ltd.	Q311-02	Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.	NB026143	Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator	ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd	GNP-9080BS-	Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	A600331	Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed	Nanjing Agricultural University	N/A	"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0	The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences	N/A	Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011918	Used to prepare MSgg media.
Fridge	Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.	BCD-556WKPM(Q)	Used for strain preservation.
Glutamate	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010618	Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket	Yulv Furniture Store	6526262626	Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10017618	Used to prepare MSgg media.
MgCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	7791186	Used to prepare MSgg media.
MnCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10400101	Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium	Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.	BES20791KB	Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O	Merck & Co., Inc.	S9390-100G	Used to prepare TSB media.
NaCI	Chinasun Specialty Products co., Ltd.	HS0416	Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O	Merck & Co., Inc.	S9638-25G	Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	E607008-0001	Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine	RYON	RT3486L005	Used to prepare MSgg media.
Pipette	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	BS-1000-T	Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.	D102A	Used to generate qPCR standard curves.
Pot	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	YHHWS2401	Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument	Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.	4484073	Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary	The Wellcome Trust SangerInstitute	N/A	Used to design primers of qPCR
Shaker	Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd	ZQTY-50S	Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77	Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.	SL77080596	Used to prepare TSB media.
Soy peptone	Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd	HB8275	Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer	Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.	76713100010	Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	SW150302	Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	223016852LLZA	Used for basic experimental operations.
Template DNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Used to prepare TSB media.
Tryptophan	Bioolook Scientific Research Special	2190020	Used to prepare MSgg media.
TSB Medium	Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.	024048	Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium	Nanjing Agricultural University	N/A	Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2	Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd	C0310520123	Used to prepare MSgg media.