使用修饰的合成寡核苷酸检测核酸代谢酶

Summary

在这里，使用连接酶、核酸酶和聚合酶的实例提出了一种检测核酸代谢酶的方案。该分析利用荧光标记和未标记的寡核苷酸，这些寡核苷酸可以组合形成模拟 RNA 和/或 DNA 损伤或通路中间体的双链体，从而可以表征酶的行为。

Abstract

商业供应商提供的一系列修饰合成寡核苷酸使开发复杂的分析方法来表征核酸代谢酶的不同特性，这些分析可以在任何标准分子生物学实验室中运行。荧光标记的使用使研究人员可以使用标准 PAGE 电泳设备和荧光成像仪使用这些方法，而无需使用放射性材料或需要专为储存和制备放射性材料而设计的实验室，即热实验室。可选添加标准修饰（如磷酸化）可以简化检测设置，而模拟 DNA 损伤或中间体的修饰核苷酸的特异性掺入可用于探测酶行为的特定方面。在这里，展示了使用市售合成寡核苷酸的酶询问 DNA 加工的几个方面的测定的设计和执行。这些包括连接酶连接或核酸酶降解不同 DNA 和 RNA 杂交结构的能力、DNA 连接酶对辅因子的差异使用以及酶 DNA 结合能力的评估。讨论了设计合成核苷酸底物时需要考虑的因素，并提供了一组可用于一系列核酸连接酶、聚合酶和核酸酶测定的基本寡核苷酸。

Introduction

所有生命形式都需要核酸加工酶来执行基本的生物过程，包括复制、转录和 DNA 修复。这些途径的关键酶功能是聚合酶（产生 RNA/DNA 分子的副本）、连接多核苷酸底物的连接酶、降解多核苷酸底物的核酸酶以及解旋酶和拓扑异构酶（熔化核酸双链体或改变其拓扑结构 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 .此外，其中许多酶为克隆、诊断和高通量测序等应用提供了必要的分子工具 11,12,13,14,15。

Protocol

1. 寡核苷酸的设计与购买

注：设计单链寡核苷酸以组装并退火成所需的双链体。双链体中的一条或多条链必须带有荧光部分，用于追踪目标酶的寡核苷酸加工。 表 1 提供了一组可以组装用于一系列活动的单链序列的基本集。

1. 如下所述，掺入目标酶所需的特定修饰。
   1. 对于 DNA 连接酶底物（图 1）：从三个寡核苷酸中?.......

Discussion

协议中的关键步骤
寡核苷酸设计和购买：购买用于双链体形成的寡核苷酸时，必须考虑序列设计。建议在订购⁵⁷ 之前，使用寡核苷酸分析仪工具预测核苷酸序列的性质，例如 GC 含量、熔解温度、二级结构和二聚化电位。

核酸双链体的组装和退火：制备 RNA/RNA-DNA 双链体时，应注意使用不含 RNase 的试剂和水或添加 RNAse 抑制剂（只要所研究的酶?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)	BioRad	1610156
Adenosine triphosphate (ATP)	Many suppliers
Ammonium persulfate (APS)	Many suppliers
Benchtop centrifuge	Many suppliers
Borate	Many suppliers
Bromophenol blue	Many suppliers
Dithiothreitol (DTT)	Many suppliers
Electrophoresis system with circulating water bath	Many suppliers
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Many suppliers
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000	Thermo Fisher Scientific	A32752
Formamide	Many suppliers
Gel casting system	Many suppliers
Heating block	Many suppliers
Magnesium Chloride	Many suppliers		Other metal ions may be preferred depending on the protein studied
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Many suppliers
Micropipettes and tips	Many suppliers		1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)	Many suppliers
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	NA	Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript and others also supply these
pasture pipette	Many suppliers
PCR thermocycler	Many suppliers
PCR tubes	Many suppliers
RNAse away	ThermoFisher	7002PK	Only needed when working with RNA oligos
RNase AWAY	Merck	83931-250ML	Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces
RNAse-free water	New England Biolabs	B1500L	Only needed when working with RNA oligos
Sodium Chloride	Many suppliers
SUPERase IN RNase inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)
SYBR Gold	Thermo Fisher Scientific	S11494	This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides
Tetramethylethylenediamine (TMED)	Many suppliers
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane	Many suppliers
Ultrapure water (Milli-Q)	Merck
urea	Many suppliers
Vortex	Many suppliers