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在这里,使用连接酶、核酸酶和聚合酶的实例提出了一种检测核酸代谢酶的方案。该分析利用荧光标记和未标记的寡核苷酸,这些寡核苷酸可以组合形成模拟 RNA 和/或 DNA 损伤或通路中间体的双链体,从而可以表征酶的行为。
商业供应商提供的一系列修饰合成寡核苷酸使开发复杂的分析方法来表征核酸代谢酶的不同特性,这些分析可以在任何标准分子生物学实验室中运行。荧光标记的使用使研究人员可以使用标准 PAGE 电泳设备和荧光成像仪使用这些方法,而无需使用放射性材料或需要专为储存和制备放射性材料而设计的实验室,即热实验室。可选添加标准修饰(如磷酸化)可以简化检测设置,而模拟 DNA 损伤或中间体的修饰核苷酸的特异性掺入可用于探测酶行为的特定方面。在这里,展示了使用市售合成寡核苷酸的酶询问 DNA 加工的几个方面的测定的设计和执行。这些包括连接酶连接或核酸酶降解不同 DNA 和 RNA 杂交结构的能力、DNA 连接酶对辅因子的差异使用以及酶 DNA 结合能力的评估。讨论了设计合成核苷酸底物时需要考虑的因素,并提供了一组可用于一系列核酸连接酶、聚合酶和核酸酶测定的基本寡核苷酸。
所有生命形式都需要核酸加工酶来执行基本的生物过程,包括复制、转录和 DNA 修复。这些途径的关键酶功能是聚合酶(产生 RNA/DNA 分子的副本)、连接多核苷酸底物的连接酶、降解多核苷酸底物的核酸酶以及解旋酶和拓扑异构酶(熔化核酸双链体或改变其拓扑结构 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 .此外,其中许多酶为克隆、诊断和高通量测序等应用提供了必要的分子工具 11,12,13,14,15。
1. 寡核苷酸的设计与购买
注:设计单链寡核苷酸以组装并退火成所需的双链体。双链体中的一条或多条链必须带有荧光部分,用于追踪目标酶的寡核苷酸加工。 表 1 提供了一组可以组装用于一系列活动的单链序列的基本集。
通过 DNA 连接酶进行连接
当在尿素 PAGE 凝胶上观察时,DNA 连接酶活性将导致荧光标记的寡核苷酸的大小增加。在 表 2 中列出的 DNA 和 RNA 连接的底物的情况下,这相当于大小从 20 nt 增加到 40 nt(图 3A)。最佳酶活性可以通过改变条件来确定,例如温度、蛋白质浓度或孵育时间(图 3B)核苷酸辅因子、金属辅因子(
协议中的关键步骤
寡核苷酸设计和购买:购买用于双链体形成的寡核苷酸时,必须考虑序列设计。建议在订购57 之前,使用寡核苷酸分析仪工具预测核苷酸序列的性质,例如 GC 含量、熔解温度、二级结构和二聚化电位。
核酸双链体的组装和退火:制备 RNA/RNA-DNA 双链体时,应注意使用不含 RNase 的试剂和水或添加 RNAse 抑制剂(只要所研究的酶?.......
AW 得到了卢瑟福发现奖学金 (20-UOW-004) 的支持。RS 是新西兰 南极邮政奖学金 的获得者。SG 和 UR 感谢特罗姆瑟大学 - 挪威北极大学化学研究所提供的技术支持。
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1) | BioRad | 1610156 | |
Adenosine triphosphate (ATP) | Many suppliers | ||
Ammonium persulfate (APS) | Many suppliers | ||
Benchtop centrifuge | Many suppliers | ||
Borate | Many suppliers | ||
Bromophenol blue | Many suppliers | ||
Dithiothreitol (DTT) | Many suppliers | ||
Electrophoresis system with circulating water bath | Many suppliers | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Many suppliers | ||
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000 | Thermo Fisher Scientific | A32752 | |
Formamide | Many suppliers | ||
Gel casting system | Many suppliers | ||
Heating block | Many suppliers | ||
Magnesium Chloride | Many suppliers | Other metal ions may be preferred depending on the protein studied | |
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Many suppliers | ||
Micropipettes and tips | Many suppliers | 1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL | |
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) | Many suppliers | ||
Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | NA | Thermo Fisher, Sigma-Aldrich, Genscript and others also supply these |
pasture pipette | Many suppliers | ||
PCR thermocycler | Many suppliers | ||
PCR tubes | Many suppliers | ||
RNAse away | ThermoFisher | 7002PK | Only needed when working with RNA oligos |
RNase AWAY | Merck | 83931-250ML | Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces |
RNAse-free water | New England Biolabs | B1500L | Only needed when working with RNA oligos |
Sodium Chloride | Many suppliers | ||
SUPERase IN RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based) |
SYBR Gold | Thermo Fisher Scientific | S11494 | This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides |
Tetramethylethylenediamine (TMED) | Many suppliers | ||
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane | Many suppliers | ||
Ultrapure water (Milli-Q) | Merck | ||
urea | Many suppliers | ||
Vortex | Many suppliers |
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